复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究

【作者】 刘忠泉； 张宗德； 邢爱英； 陈曦； 李自慧； 古淑香； 贾红艳； 杜博平； 马玙；

【机构】 北京市结核病胸部肿瘤研究所；

【摘要】 目的研究复苏因子蛋白对休眠结核杆菌生长的影响,探索促进休眠结核杆菌复苏的最佳方案。为提高临床标本结核杆菌培养阳性率,缩短培养时间提供帮助。方法 （1）休眠 H₃₇ Rv 标准株：取对数生长期 H₃₇ Rv 标准株在无氧条件下培养100 d。配成浊度为麦氏1的悬液。（2）取13支无菌15 ml 离心管,各加入7ml 新鲜7H9（含 0．01%吐温80,100μg/ml 氨苄青霉素）,12支管加入不同浓度的复苏因子蛋白（rpf）（见表1）,并设不加复苏因子蛋白质的对照组,13支管分别加入100ul 休眠 H₃₇Rv,置37℃培养,分别在第6、 11、16、30 d 用分光光度计检测 OD 值；重复做3 份实验。（3）培养物中结核杆菌的细菌学鉴定：取 10ul 培养物涂7H11平板。培养20 d 做菌落计数, 以证明为慢生长菌。取2 ul 培养物直接涂片抗酸染色,以证明为抗酸杆菌。结果 （1）低浓度 rpfD 无复苏作用,低浓度 rpfA、B、C、E 和5种 Rpf 低浓度组合均在培养10 d 后开始复苏生长,在 15～20d 进入对数生长期,而对照10d 后开始缓慢生长,30d 培养中未进入对数生长期,低浓度组合复苏作用好于单独使用各复苏因子蛋白。7H11培养菌落计数结果与 OD 值检测结果一致,抗酸染色证明无污染。（2）高浓度 rpfA、D 和高浓度组合等无复苏作用,高浓度组合 OD 值在各期均低于对照组,RpfB、C、E 在培养15～20d 进入对数生长期。对照10d 后开始缓慢生长,30d 培养中未进入对数生长期。7H₁₁培养菌落计数结果与 OD 值检测结果一致,抗酸染色证明无污染。（3）不同浓度 Rpf 的复苏作用比较：RpfA 在高浓度无复苏作用, 低浓度复苏作用明显；RpfB 高、低浓度均有复苏作用,但低浓度作用大于高浓度；RpfC 均有复苏作用,但高浓度作用大于低浓度；RpfD 两浓度均无复苏作用；RpfE 均有复苏作用,且两浓度作用效果相同；低浓度组合复苏促进作用明显,高浓度组合有抑制复苏作用倾向。结论复苏因子蛋白质能有效的促进休眠结核杆菌迅速生长,结果证实低浓度组合有明显的复苏促进作用,好于单独各因子的复苏促进作用。而高浓度组合则抑制细菌复苏生长,从复苏效果分析,低浓度组合 (Rpf_{A1．6nM、B1．4nM、C4．7nM、D1．5nM、E1．2nM})为最佳复苏方案。更多还原