家蚕卵核酸群体印渍技术的研究

【作者】 韦亚东； 张国政； 张月华； 汪生鹏； 李细清； 陆长德；

【机构】 中国农业科学院蚕业研究所； 中国科学院上海生物化学研究所；

【摘要】 为了研究家蚕个体发生和胚胎组织发育分化过程中基因的时序表达调控作用,必须开发适合于蚕卵个体水平的特异性DNA和RNA序列杂交检测技术.本文选择丝素基因的部分序列为探针,对群体印渍技术（Clony blot）应用于蚕卵细胞的适宜条件进行了探讨,现概要如下.取样不同发育阶段的家蚕卵及蚁蚕,刺破后压出卵内容物以5mm间距涂在硝酸纤维系膜上,同时,以抽提的纯家蚕DNA为阳性对照,大肠杆菌为阴性对照分别点样.将携带样品的膜放入含有终浓度为100μl的蛋白酶K的消化液中,56℃消化3—4小时;碱变性液中浸泡10分钟,分别移至缓冲液1中5分钟,缓冲液2中5分钟;暴露在空气中20分钟;将膜在95%的乙醇中脱水.再在空气中干燥;用24:1的氯仿异戊醇漂洗后,空气中干燥1.5分钟,最后用0.3M的氯化钠溶液清洗膜,以除去残留的一些细胞碎片,再用强紫外灯交联.用4ml 预杂交液在45℃预杂交1小时,然后换杂交液,并加人 ³²P—ATP标记的家蚕丝素基因的序列（34bp）探针,在45℃杂交过夜;分别在45℃用洗脱液1洗1次、洗脱液2洗2次:将膜用保鲜膜包好,压片24小时后洗片.放射自显影结果表明,阳性对照及分别发育1天、3天、5天、7天及蚁蚕的点样点均有明显的杂交信号出现,而阴性对照无杂交信号,各点样点之间亦未见杂交信号.更多还原