应用免疫磁珠分离和荧光显色法对单克隆抗体干板检测HLA-B27的方法改进

【作者】 徐忠玉； 张阳根； 李燕斌； 朱小东；

【机构】 解放军第175医院检验科；

【摘要】 目的美国莱姆德公司(One lambda,Inc)的单克隆抗体干板法,是目前检测HLA-B27常用方法,其中淋巴细胞的分离普遍采用淋巴细胞分离液离心法分离,染料一般为1-4g/dl的曙红或2g/dl的胎盘蓝溶液,我们在进行检测时,发现存在着不少缺点。我们利用开展单克隆抗体干板法(莱姆德公司)进行HLA组织配型的有利条件,将其中的免疫磁珠分离技术和荧光显色技术,应用到HLA-B27检测上,取得满意的效果。方法淋巴细胞分离(1)肝素抗凝血标本2000pr/min离心5分钟,去白膜层后混匀;(2)吸取2ml全血加入试管中,加入PH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)2ml,再加入I类免疫磁珠分离液50ul,加盖充分混匀3分钟,去盖插入磁珠架3分钟;(3)吸取上清液,加4ml PBS吹打(避免气泡产生)混匀1分钟,再上磁珠架1分钟,并重复洗涤一次;(4)吸取上清液,用PBS调节淋巴细胞浓度至约2000/ul。加样:每孔分别加1ul无菌水溶解抗体、1ul淋巴细胞、1ul补体,加5ul石蜡油封板,置25℃1小时。每孔加荧光终止液5ul显色。结果反应板直接置于在荧光倒置显微镜下进行读板:死亡细胞0-10%为阴性,11-20%为可疑阴性,21-50%为弱阳性,51-80%为阳性,81-100%强阳性。结论改进前,分离的淋巴细胞悬液中常混入大量的血小板,有时会混入一定数量的红细胞;分离过程中,洗涤离心后容易形成细胞块,使细胞量减少,分离、离心时间也较长;显色时由于死亡细胞和背景着相同颜色,虽有所深浅,但反差不明显,且血小板、红细胞等杂质影响结果观察,结果不易判读。免疫磁珠分离淋巴细胞的原理是在免疫磁珠上包被T淋巴细胞抗体,与血中T淋巴细胞结合形成抗原抗体复合物,在磁珠架上分离,因HLA-B27为HLAI类抗原,故此免疫磁珠称I类磁珠。荧光终止液(FQAE)的主要成分是AcidlineOrange(AO)和Ethidium Bromide(EB),其中AO与细胞膜结合呈绿色荧光,EB则通过受损的细胞膜与DNA结合红色荧光。应用免疫磁珠分离淋巴细胞,其特异性强,分离纯度高,不受血小板、红细胞等干扰,且不需离心,分离时间短;应用荧光终止液着色,死、活细胞分别呈红色、绿色,颜色分明,且背景为黑色而无其它杂质干扰,在荧光倒置显微镜下,三色反差明显,判读清晰、容易,一目了然。更多还原