免疫抑制小鼠巨噬细胞Toll样受体的表达

【作者】 顾克菊； 马越云； 苏明权； 杨军兰； 郝晓柯； 于文彬；

【机构】 第四军医大学西京医院检验科；

【摘要】 目的Toll样受体是一类可激活人体天然免疫,在感染早期发挥保护性作用的重要膜受体家族,有限的TLR家族成员可对相对广泛的病原微生物进行识别,引起一系列免疫效应。TLRs基因敲除实验证实,不同的TLR基因缺陷小鼠对不同的病原微生物易感性增加,存活率下降。本实验检测免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达变化,探讨免疫抑制宿主对机会性致病菌易感的分子机制。方法实验动物选用BALB/C小鼠,分2组:①免疫抑制组,腹腔内注射“甲基强的松龙”,②正常对照组,腹腔内注射“注射用水”,每组12只小鼠。免疫抑制组小鼠皮下注射甲基强的松龙100 mg/kg/d。共3d。正常对照组小鼠皮下注射同体积注射用水。第4日脱颈处死小鼠,用注射器吸取5ml无血清培养液注入腹腔,轻揉腹腔1～2 min,用吸管吸取腹腔巨噬细胞悬液,移入离心管中计数。TRIZOL一步法提取巨噬细胞RNA。紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLRs表达变化:每份RNA样品均取2μg进行逆转录,严格按逆转录M-MLV试剂盒说明进行操作,cDNA合成的引物选用Random Primers,反应条件为37℃,60min,反应产物于94℃灭活5min。实验用引物根据GenBank公布的TLRs序列自行设计,并委托上海生工生物工程技术服务公司合成。PCR反应条件为95℃30s,55℃30s,72℃30s,循环数32,最后72℃7 min,使反应完全。扩增产物检测在凝胶成像系统中分析电泳带的吸光度值。TLRs的相对含量为TLRs与内参β-actin吸光度比值表示。结果糖皮质激素甲綦强的松龙注射后小鼠免疫细胞数量急剧下降,腹腔巨噬细胞数量明显减少(5.683±2.635×10~6vs3.117±0.9495×10~6 p<0.001),外周血淋巴细胞百分比下降,脾脏萎缩,脾细胞数量减少,小鼠机体免疫力受到严重抑制。;TLR1-13在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达;糖皮质激素甲基强的松龙在mRNA水平上可上调巨噬细胞部分TLRs的表达,增加值可达1～2倍。结论免疫抑制小鼠机体免疫细胞数量减少是造成小鼠对机会性致病菌易感的机制之一;糖皮质激素可上调巨噬细胞部分TLRs的表达。更多还原