氯霉素抗性融合蛋白报告系统的建立与验证

【作者】 王爱娥； 张睢扬； 董书魁； 梅开城； 马建新； 王东霞； 王英；

【机构】 第二炮兵总医院呼吸内科； 第二炮兵总医院检验科；

【摘要】 目的以表达载体pMal-p2X为基础,以氯霉素乙酰基转移酶(CAT)为报告基因,构建在N端与目的蛋白融合的表达载体,使表达的CAT能即时反映目的蛋白的折叠状态。并对该系统进行验证。方法PCR法扩增CAT基因,引物中分别引入酶切位点、linker、终止密码子,连接到pMal-p2X载体上,构建pCAR和pCAR(阳性)表达质粒并作测序鉴定,同法克隆IGF、IL-3、TRx基因,连接到pCAR载体上,导入大肠杆菌原核表达系统中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳、氯霉素抗性试验检验表达蛋白的状态和相应氯霉素抗性的相关性。结果测序结果显示构建的pCAR序列正确,用该载体表达的重组蛋白的表达状态与氯霉素抗性指示相一致。结论成功构建了以大肠杆菌为宿主的CAT报告系统,CAT能正确指示其N端融合的目的蛋白的表达状态。为其在生物工程和蛋白质构象相关疾病研究等领域中的应用打下基础。更多还原