人肠三叶因子的重组表达及其在烧伤后胃肠粘膜屏障重建中的作用

【作者】 孙勇； 张勇； 吕尚军； 吴炜； 彭曦；

【机构】 第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室；

【摘要】 目的筛选并构建 rhITF 理想的表达系统,优化表达条件,提高表达产量,获得高纯度的重组蛋白,并对重组表达的 rhITF 的理化性质进行系统研究,探讨 rhITF 在烧伤后胃肠粘膜屏障重建中的作用。方法通过 RT—PCR 获得 rhITF 成熟肽全长基因序列,克隆至质粒 pET32a 获得重组载体,经 BspHI 线性化后氯化锂转化进入毕赤酵母 X-33,Zeocin 筛选阳性转化子,菌落 PCR 验证目的基因:挑取阳性克隆于 YPD 中进行组成性表达,表达上清经三步纯化法获取 rhITF, 通过 N 端测序、肽指纹图谱及质谱分析鉴定重组蛋白。通过模拟胃肠环境,对重组蛋白各项稳定性实验,最后通过体外、体内实验观察 rhITF 对烧伤后胃肠粘膜屏障的保护作用。结果成功构建重组酵母表达载体 pGAPZaA-hITF,筛选出整合 hITF 成熟肽基因的稳定酵母菌株;组成性表达的产量为80mg/L,三步纯化后 rhITF 的纯度 N 端测序结果与理论序列完全一致,肽指纹图谱的匹配率为 100%,质谱分析显示 rhITF 的分子量为7,879.38Da,与理论值(7679.7Da)基本一致。稳定性实验显示,rhITF 具有抵御消化酶分解、耐酸碱和耐热的特性。体内外实验结果显示,rhITF 能促进细胞增殖和移行,加快受损受损粘膜的修复,烧伤小鼠每天给予1mg/kg 的 rhITF 灌胃,显著降低胃肠粘膜受损程度,胃粘膜损伤指数明显下降(5.33±4.58vs0.6±1.26,P<0.01):胃肠病理改变明显减轻,烧伤对照组以出血、坏死和溃疡为主,ITF 组以充血、水肿为主,同时肠粘膜厚度、绒毛高度、隐窝深度明显增加,小鼠5天病死率明显下降(20.3%vs41.6%,P<0.05))。结论酵母表达的 rhITF 一级结果正确,信号肽酶切完全,未发生糖基化,具有良好的抗原性,自然状态下以二聚体为主要形式。rhITF 是一种高度稳定的小分子蛋白,具有极强的蛋白酶抗性,酸、碱及热稳定性。rhITF 具有很高的生物活性,对烧伤后胃肠道损伤具有明显的治疗作用,能促进受损粘膜屏障的重建。更多还原