【作者】 罗何峰； 王劼； 苟钟勇； 彭健；

【Author】 Luo Hefeng, Wangjie, Gou zhongyong, Peng Jian (College of Animal Science and Technology, Hua zhong Agriculture University, Wuhan 430070, China)

【机构】 华中农业大学动物科技学院；

【摘要】 <正>肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要的病原菌之一。ETEC特异性菌毛的黏附作用是ETEC致病的先决条件,若能有效抑制ETEC在小肠上的黏附,则可以预防仔猪腹泻的发生。987P是ETEC一种较为常见的菌毛基因型。FasG是987P菌毛合成所必需的亚单位,也是产生黏附作用的主要蛋白。本研究拟构建高效表达987P菌毛黏附素基因厂口sG 的基因工程菌,并对FasG蛋白进行抗原表位预测,为987P基因工程疫苗和卵黄抗体的抗原生产提供技术支撑。试验根据Genebank中已报道的fasG序列(登录号:L29412)设计引物,以987P标准菌株 (C83916)为模板,PCR扩增出不含信号肽的fasG基因片段。将回收的fasG片断插入pMD18-T载体中,构建fasG基因的克隆质粒pMD18G。双酶切质粒pMD18G获得黏性末端的fasG片断,与同样双酶切过的表达载体pET28a(+)连接转化,构建fasG的重组表达质粒pET28aG。经测序后,转化质粒 pET28aG至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组菌。用IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。根据FasG蛋白的氨基酸序列,用ANTHEPROT5．0软件对决定其抗原表位的疏水性、亲水性、表面可及性以及抗原性进行单参数预测。另外,使用PBIL(Pole Bioinformatique Lyonnais)数据库,采用SOPMA 服务器(http:／／npsa-pbil．ibcp．fr／cgi-bin／npsa_automat．pl?page=／NPSA/npsa_sopma．html)对FasG蛋白的二级结构进行预测。之后综合单参数预测和二级结构预测的结果分析其可能的抗原表位。试验结果显示: (1)重组菌BL21(pET28aG)的诱导表达产物包括:分子量分别为40kDa、33kDa和18kDa的蛋白, 其中目的蛋白(40kDa)表达量较低,主要存在于上清中;分析fasG序列,推测存在mRNA的二级结构、次级翻译起始位点以及目的基因编码区稀有密码子含量较高可能是导致表达产物出现杂蛋白且表达量偏低的主要原因;(2)FasG蛋白的单参数预测和二级结构预测的结果显示,比较容易形成抗原表位的区域为(从N端起始):18-22、46-50、88-93、113-122、166-172、203-208、220-239、278-289。更多还原