【作者】 任晓慧； 张永亮； 刘松财； 戴建成； 郝林琳； 章倩倩； 侯峰； 吕铁钢； 周立光； 吴琼； 卢可； 齐剑英；

【Author】 REN Xiaohui, ZHANG Yongliang, LIU Songcai, DAI Jianwei, HAO Linlin, ZHANG Qianqian, HOU Feng, LV Tiegang, ZHOU Liguang, WU Qiong, LU Ke, QI Jianying (College of Animal Science, South China Agricutural University, Guangzhou 510642, China; College of Animal Science and Veterinary medicine, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; College of Ocean Science, Hebei Agricultural University, Qinhuangdao 066000, China)

【机构】 吉林大学农学部畜牧兽医学院； 华南农业大学动物科学学院；

【摘要】 <正>生长激素释放激素(GHRH)和生长激素释放抑制因子(SS或GHRIH)是生长激素(GH)的正、负调控因子,表达GHRH的同时免疫中和SS,完成对GH的双向调节(增强正调节作用、减弱负调节作用),在理论上具有更好的生长调控作用。试验根据RNA复制子真核表达载体(pCMV-repLacZ)的特点,选择LacZ基因两端的BamH I作为外源基因插入位点,利用BamH I和BgLII互为同尾酶,设计GHRH引物,序列如下:引物1:5、CGGAATTCATGCTGCTCTGGGTGTTC3’;引物2: 5、GAAGATCTTTACCCCTGCTGCCTGCTTAT3’。以本室构建的pIRES-GHRH-HBsAg-SS为模板,扩增 GHRH基因片段,用EocR I和BgLII酶消化后,与pIRES-GHRH的EocR I和BamH I酶切大片段用 T4连接酶连接,之后转化大肠杆菌DH5 α感受态,经酶切、PCR及测序鉴定。鉴定正确后,合成含有 BamH I酶切位点GHRH5’端引物,以及含有BamH I酶切位点HBsAg-SS3’端引物,引物序列如下: 引物1:5’CGGGATCCATGCTGCTCTGGGTGTTC3’;引物2:5’CGGGATCCCTAACAGGATGTGAAA3’。以已经改造过的pIRES-GHRH-HBsAg-SS为模板,扩增双基因片段,扩增产物经纯化连接到pGEM-T 载体上,经酶切、PCR及测序正确后,用BamH I酶切重组质粒,得到两端含有BamH I黏性末端的 GHRH-HBsAg-SS目的片段,同时用BamH I酶切pCMV-rep-LacZ,得到载体大片段,用碱性磷酸酶去磷酸化后,与目的片段用T4连接酶连接,电转化至大肠杆菌DH10B感受态,蓝白斑筛选重组质粒,经酶切,PCR, 方向鉴定正确后, 获得重组质粒pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS。将 pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS转染BHK细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR,检测结果证明质粒成功转染细胞,并转录正确;回收细胞培养上清液,经Tricine-SDS-PAGE,Dot-blot,Western Blotting, 间接ELISA检测到目的蛋白表达。本试验构建了基于RNA复制子的GHRH和SS双基因真核表达载体 pCMV-rep-GHRH-HBsAg-SS,并成功地实现了在细胞中的表达,这为下一步GH双向调节基因表达系统的研究打下基础。更多还原