腺相关病毒介导hTGF-β1和hTGF-β3双基因体内联合转染对兔退变椎间盘的生物学效应

【作者】 刘海飞； 王德春； 胡有谷；

【机构】 青岛大学医学院附属医院骨科山东省创伤骨科研究所；

【摘要】 目的应用腺相关病毒（adenoassociated virus,AAV）介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor-β1,hTGF-β1）和β3（hTGF-β3）双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质合成的生物调节作用。方法 28只新西兰大白兔注射纤维结合素片段（fibronectin fragment,Fn-f）制造椎间盘退变模型。术后4周,28只兔随机分为4组,第一组8只,椎间盘髓核内注射 AAV-hTGF β1或磷酸盐缓冲液（PBS）；第二组6只,注射 AAV-hTGFβ3或 PBS；第三组6只,联合注射 AAV-hTGFβ1和 AAV- hTGF β 3,空白对照组注射 PBS；第四组8只,注射腺相关病毒介导的增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）或 PBS。1周后处死第一组中2只兔,收获髓核组织,制作冰冻切片,免疫组化法观察 hTGF-β 1的表达；基因转导后4、8、12周每组处死2只兔取髓核组织组织培养和裂解,³⁵S 整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量,免疫印迹 Western-Blot 法检测髓核Ⅱ型胶原的含量。术后12周时处死第四组中2只兔,观察 EGFP 的表达。结果 （1）AAV-hTGFβ1转染后1周,髓核组织中 hTGF-β1含量较自身对照椎间盘显著增多；（2）基因转染4周、8周、12周,各基因转染组髓核组织中新合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原与自身对照 PBS 组相比均有显著增高,转染 EGFP 组同 PBS 组比较无显著差异；（3）基因转染4周、8周、12 周,各基因转染组新合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原较转染 EGFP 组显著增高,转染 hTGF-β1和 hTGF-β 3组间无显著差异,双基因转染组较单基因转染组合成量显著增高。（4）AAV-EGFP 转染后12周,髓核组织中可以观察到大量绿色荧光的表达。结论 AAV 作为新型基因转导载体可以有效介导治疗基因体内转染兔退变的髓核细胞,基因产物持续表达＞12周；治疗因子 hTGF-β1和 hTGF-β3可有效促进退变髓核细胞基质的合成,双基因联合转染具有协同作用。更多还原