山核桃CcLFY基因及其启动子克隆与功能鉴定

【作者】 王正加； 黄有军； 郑炳松； 夏国华； 金松恒； 黄坚钦；

【机构】 浙江林学院；

【摘要】 LEAFY(LFY)基因是决定花分生组织形成的关键基因,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得山核桃LFY同源基因CcLFY全长cDNA 1442bp(GenBank注册号为DQ989225)。其中,开放阅读框(ORF)1158 bp,编码385个氨基酸(包括起始密码子ATG)和一个终止密码子TAA,推测其分子量为43.5KD。cDNA序列中包含有脯氨酸富集区、中央酸性域、亮氨酸拉链结构及由赖氨酸和精氨酸残基形成的碱性域等一些转录因子的结构特征。该基因编码的氨基酸与板栗、毛果脂杨、褪色柳、拟南芥的同源性为89.2%、83.7%、83.6%、65.6%。以DNA为模板,进行PCR扩增,得到了山核桃CcLFY基因转录区序列。包含两个内含子和三个外显子,内含子1长为548bp,内含子2长1175bp,两内含子的剪切点位置均符合GT-AG规律。Southern杂交结果表明:CcLFY基因在山核桃中以单拷贝形式存在。构建了pCAMBIA1301-35S-CcLFY-NOS表达载体,并已转入烟草,等待下一步基因功能验证。通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对CcLFY基因进行了时空表达分析,结果表明:CcLFY基因在山核桃花芽、幼茎和叶中多有表达,花芽中表达量最高,但在根中几乎没有检测到CcLFY基因表达。以山核桃DNA为模板,利用锚定PCR步移法克隆到CcLFY基因下游部分序列。该序列全长为1273bp。经PLACE软件分析表明,该序列具有真核生物启动子序列的一般特征。包括了转录起始点26bp处的TATA框位和92bp处的CAAT框。为了检测CcLFY基因启动子的活性,利用双酶切置换含的GUS基因的表达载体pBI121中的35S,建立了新的植物表达载体,转入烟草叶片进行瞬时表达,结果表明CcLFY基因启动子具有驱动GUS表达的活性。更多还原