Cyclin D1反义寡核苷酸转导细胞对cyclin D1基因的影响

【作者】 周晓健； 张萍； 潘红芽； 陈万涛；

【机构】 上海第二医科大学附属第九人民医院；

【摘要】 目的:构建细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的反义寡核苷酸真核表达载体并检测其转染Tca8113、Tca8113/CDDP细胞系后的表达情况。方法:以Tca8113/CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cvclin D1全长,通过克隆至PUCM-T载体中测序完全正确后,经IPTG诱导,可正确表达蛋白,上下游分别引入Hind Ⅲ和EcoRI的酶切位点并插入真核表达载体pcDNA3.1,测序鉴定,再构建表达cyclin D1反义RNA的两个重组载体,通过Lipofectamine将其分别导入Tca8113与Tca8113/CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系;通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1基因表达。结果:成功构建pcDNA3.1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为pcDNA 3.1空载(Co)、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义mRNA(C5’)、cyclin D1mRNA 3’端为靶区的反义mRNA(C3’)、cyclin D1正义mRNA(CD1)。反义寡核苷酸5’端转染细胞后cyclinD1 mRNA水平被抑制率58.8%,而mRNA 3’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化阳性表达正义为最高,转导mRNA3’,mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论:cyclon D1 mRNA5’端反义寡核苷酸能明显抑制cvclin D1在Tca8113/CDDP中表达,为进一步研究逆转Tca8113/CDDP耐药性提供实验工具。更多还原