【作者】 周晓健； 张萍； 陈万涛； 潘红芽； 何荣根； 邱蔚六；

【Author】 ZHOU Xiao-jian, ZHANG Ping, CHEN Wan-tao, PAN Hong-ya, HE Rong-gen, Qiu Wei-liu Dept. of Oral & Maxillofacial Surgery, Affiliated Ninth People’s Hospital, Shanghai Second Medical University

【机构】 上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科；

【摘要】 目的建立耐顺铂(CDDP)人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113／CDDP,对其耐药特性进行研究。方法应用间歇性加药,逐步递增剂量,体外连续诱导培养方法,获得:Tca8113耐药细胞。对细胞倍增时间、裸鼠成瘤性、MTT检测化疗药物敏感性,对细胞周期蛋白表达进行研究,以Tca8113／CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cyclin D1全长,通过克隆至PUCMoT载体中,测序完全正确,经IPTG诱导,可正确表达蛋白。上下游分别利用Hind III和EcoRI 的酶切位点插入真核表达载体pcDNA3．1,测序鉴定。并构建表达cyclin D1反义寡核苷酸的两个重组载体,通过Lipofectamine将其导入Tca8113／CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系;通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1 基因表达。结果初步建成耐CDDP的人舌鳞癌细胞系(Tca8113／CDDP),其耐 CDDP浓度为9．2倍。该细胞同时对卫猛(Vm-26)、博来霉素(BLM)、长春地辛 (VDS)、表阿霉素(E-ADM)、泰素(Taxol)等化疗药物产生交叉耐药。CDDP作用 Tca8113细胞后, 电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带,耐药细胞 Tca8113／CDDP则无。成功构建pcDNA3．1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为 pcDNA 3.1空载(Co)、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义mRNA(C5’)、cyclin D1 mRNA 3’端为靶区的反义mRNA(C3’)、cyclin D1正义mRNA(CD1)。5’端反义寡核苷酸端转染细胞后cyclin D1 mRNA表达水平降低58.8％,而mRNA 3’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化结果示,转导正义寡核苷酸组cyclin D1阳性表达为最高,转导mRNA3’端,mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论 CDDP能诱导Tca8113细胞耐药性。Tca8113／CDDP细胞系具有多药耐药特性。成功构建cyclin D1寡核苷酸真核表达载体,RT-PCR与免疫组化均证实mRNA5’端反义寡核苷酸能明显抑制cyclin D1在Tca8113／CDDP中表达,为进一步研究逆转Tca8113／CDDP耐药提供实验工具。更多还原