小鼠Hsp10基因腺病毒载体的构建及在卵泡中的表达

【作者】 凌静； 李梅； 马翔； 薛凯； 刁飞扬； 崔毓桂； 刘嘉茵；

【机构】 南京医科大学第一附属医院生殖医学中心；

【摘要】 目的:前期研究发现Hsp10蛋白水平在PCOS患者卵巢组织中明显低于正常人卵巢组织【2】。为了更好地研究Hsp10蛋白在PCOS发病中的作用,我们利用AdEasy系统,构建小鼠Hsp10基因重组腺病毒载体,并在卵泡中表达。方法:用RT-PCR的方法从小鼠卵巢组织中扩增Hsp10基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-Hsp10。Pme I酶切pAdtrack-Hsp10,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdtrack-Hsp10转化至BJ25183感受态细菌中进行同源重组。Pac I酶切线性化重组质粒AdCMV-Hsp10后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。通过GFP报告基因观察重组病毒的产生。用获得的重组腺病毒感染小鼠卵泡,用Western blot方法检测Hsp10基因的表达。结果:用RT-PCR方法,从小鼠卵巢组织中扩增出309bp的片段,测序证实为小鼠Hsp10基因。构建了小鼠Hsp10基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组腺病毒。重组的腺病毒感染小鼠卵泡后,Western blot法证实Hsp10表达。结论:成功构建了小鼠Hsp10基因重组腺病毒载体,并且在小鼠卵泡中有效表达,为进一步研究Hsp10蛋白在相关疾病中的作用奠定了基础。更多还原