家蚕孵化酶样基因的克隆及其基因组结构和卵期表达分析

【作者】 卢福浩； 唐顺明； 沈兴家； 王娜； 赵巧玲； 张国政； 郭锡杰；

【机构】 江苏科技大学； 农业部家蚕生物技术重点开放实验室； 中国农业科学院蚕业研究所；

【摘要】 孵化是大多数后生动物的一个重要生命过程,孵化酶在其中起到关键作用。家蚕作为重要的经济昆虫,蚕卵孵化率是判定蚕种质量的一个重要指标。但是,至今对家蚕孵化的分子机理还未见研究报道。我们采用电子克隆的方法,结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术,从家蚕品种Nistari转青卵中克隆获得孵化酶样的cDNA全长编码区序列(Bombyx mori hatching enzyme-like gene,BmHEL)。DNAstar和SignalP软件分析表明,BmHEL cDNA全长974 bp,含一个长885 bp的ORF(Open Reading Frame),编码294个氨基酸残基,蛋白分子量为33.767kD,等电点为6.074;在BmHEL N-端存在16个氨基酸的信号肽,酶切位点为Ala16 /Thr17。采用ClustalW软件比较了BmHEL与其它物种孵化酶氨基酸序列的同源性,BmHEL与QHE、TuHE、XHE、EHE12、ZHCE1、MHCE23、MLCE和Astacin同源性为30.8%—32.7%。SMART与Pfam软件预测BmHEL蛋白酶功能区中含有锌结合序列HEWMHILGFLHMQSTHNR和Met-转角基序SCLHY等孵化酶共有的功能区域和所在的保守位点。上述结果表明克隆的是家蚕孵化酶样基因。用BmHEL序列比对家蚕基因组草图法分析其基因组结构,结果显示BmHEL为单拷贝基因,含有6个外显子和5个内含子,边界序列符合GT/AG规则。TFSEARCH软件预测BmHEL 5’侧翼区序列,发现在转录起始位点上游-23—-30区域存在经典的TATA盒。上游启动子区内存在与胚胎发育相关的GATA-2、POU、SOX/SRY等多个潜在的转录因子结合位点,推测BmHEL可能与胚胎发育有关。采用半定量Realtime-PCR法,分析了BmHEL在蚕卵不同发育时期胚胎中的表达时相,结果显示,在胚胎发育初期(戊3胚胎之前)BmHEL有微量的表达;从戊3到己2胚胎,其表达量缓慢上升,己3胚胎急剧增加,达胚胎发育初期的89倍之多;孵化后蚁蚕中急剧下降。这暗示BmHEL可能参与了蚕卵的孵化过程。此外,我们还在家蚕幼虫中肠和马氏管中检测到BmHEL mRNA,提示其可能还有其它功能。上述结果有助于从分子水平上阐明家蚕卵的孵化机理。而BmHEL的作用方式及其表达调控机理,以及在幼虫期的功能等有待于进一步实验阐明。更多还原