融合蛋白ATF-L-VAS在毕赤酵母中的表达、纯化及初步活性研究

【作者】 徐倩； 孙启明； 李建平； 华子春；

【机构】 南京大学；

【摘要】 1目的:在毕赤酵母表达系统中实现融合蛋白ATF-L-VAS的组成型胞外分泌表达,优化表达条件,并进行分离纯化及其抑制血管生成活性研究。2方法:以原核表达载体pNJU-ALV为模版,PCR扩增得到ALV编码片段,纯化后进行Xho I和Not I双酶切,然后插入酵母组成型表达载体pGAPZαA的多克隆位点,构建穿梭质粒pGAPZαA-ALV。将其线性化后电转化入毕赤酵母Pichia pastoris X33,通过同源重组插入毕赤酵母基因组。通过PCR及小量表达筛选鉴定阳性重组子,优化表达条件,大量表达,通过75%硫铵沉淀表达上清,DEAE离子交换层析纯化,采用SDS-PAGE及Western分析鉴定,由CAM实验鉴定重组融合蛋白抑制血管生成及抑制内皮细胞增殖的活性。3结果:经PCR、酶切以及测序鉴定,DNA序列以及阅读框全部正确,pGAPZαA-ALV构建成功。PCR及少量表达筛选出阳性重组菌株并初步确定表达条件如下,表达时间:72小时;培养基:YPD(用磷酸缓冲配制pH6.0);表达温度:30℃;摇床转速:300rpm。大量表达融合蛋白ALV,通过75%硫酸胺沉淀浓缩,DEAE Sepharose Fast Flow层析进行纯化,发现目的蛋白集中在0.1M Nacl洗脱部分,纯度超过90%;利用超过0.5M的Nacl洗脱杂蛋白。利用羊抗人calretioulin特异性抗体经Western blot鉴定,在相应大小位置有特异性条带,而0.2M Nacl洗脱部分没有条带,证明了目的蛋白的特异性。CAM试验,检测Pichia pastoris X33所表达纯化得到的ALV具有抑制生血管生成活性。图1显示,ALV各个剂量组对CAM新生血管的形成均有不同程度的抑制作用,在0.1ug的剂量下就具备很明显的抑制血管生成的活性,用药后新生血管得到完全抑制或明显减少。而PBS对照组(阴性对照)则新生血管正常,新生毛细血管丰富。证明了肿瘤靶向性变体蛋白ALV的直接抗血管生成活性。4结论:在本实验中,选用Invitrogen公司的毕赤酵母野生菌株X33和组成型表达载体pGAPZαA,实现了变体蛋白的组成型胞外分泌表达。应用电穿孔转化法,将线性化的质粒转化入毕赤酵母中,通过PCR和小量表达筛选出重组菌株,并用于大量表达,DEAE纯化获得纯度高于90%的变体蛋白,其表达产量为5mg/mL。纯化后,用CAM实验验证变体蛋白的抑制血管生成的活性,表明利用毕赤酵母表达的蛋白具有生物学活性,为该蛋白的进一步研究以及临床应用奠定了基础。更多还原