慢病毒介导TNFα-Tumstatin_45-132融合基因转染间质干细胞抗前列腺肿瘤研究

【作者】 张徐； 王梅； 朱伟； 钱晖； 乔纯； 曹慧玲； 徐学静； 许文荣；

【机构】 江苏大学基础医学与医学技术学院； 江苏大学附属医院医学检验中心；

【摘要】 目的研究慢病毒载体介导入信号肽-TNFα-Tumstatin45-132(SPTT)融合基因转染的间质干细胞(MSC)体内外对前列腺肿瘤生长抑制作用。方法采用PCR从pBV220-TNFα-Tumstatin45-132载体上扩增融合基因TNFα-Tumstatin45-132并引入人GM-CSF信号肽序列,亚克隆至pMD-19T载体测序鉴定后定向克隆至慢病毒载体FUGW中。脂质体法与包装质粒pCMV-delta8.9,包膜质粒VSVG共转染293T细胞生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSC(rMSCs)后,RT-PCR、Western Blot、免疫组化、ELISA检测在rMSCs中SPTT基因的插入、蛋白表达和分泌;MTT实验分析SPTT蛋白体外对入前列腺肿瘤细胞PC3杀伤效应;Hoechst 33342/PI双染色法观察SPTT蛋白体外作用促PC3细胞凋亡情况;鸡胚形成试验研究SPTT蛋白对血管形成的抑制作用。体内研究SPTT基因转染的rMSCs瘤内注射对PC3裸鼠肿瘤模型生长抑制作用;RT-PCR分析肿瘤组织抑癌基因Rb、细胞周期蛋白p21、凋亡蛋白caspase-3和免疫相关细胞因子表达改变情况;Western Blot研究肿瘤组织中TNF凋亡途径相关蛋白表达差异;免疫组化研究肿瘤组织局部凋亡、增殖和微血管密度变化。结果慢病毒感染rMSCs后RT-PCR、免疫组化染色及Western Blot检测可见SPTT基因和蛋白表达;ELISA检测可见慢病毒感染rMSCs培养上清中SPTT蛋白分泌随培养时间延长而升高,72h达浓度最高峰为250pg/ml。MTT实验显示SPTT蛋白对PC3具有杀伤效应且呈剂量依赖性,抑制率最高达55%左右。Hoechst 33342/PI双染SPTT蛋白作用后的PC3细胞,可见其凋亡率较对照组和空载体作用组明显增加。鸡胚形成试验可见SPTT蛋白对鸡胚血管形成具有抑制作用。PC3裸鼠肿瘤模型瘤内注射SPTT基因转染的rMSCs进行治疗,可见肿瘤模型生长速度明显减缓、瘤体积和瘤重缩小;肿瘤组织抑癌基因Rb、细胞周期蛋白p21和凋亡蛋白caspase-3表达明显升高;此外肿瘤组织内IL-8表达升高,IL-10表达下降;免疫组化分析肿瘤组织切片见局部凋亡增加、增殖受抑及微血管密度减低。结论:慢病毒介导人信号肽-TNFα-Tumstatin 45-132融合基因转染的间质干细胞体内外可诱导肿瘤细胞凋亡,抗血管生成和促进抗肿瘤免疫从而抑制前列腺肿瘤生长。基于慢病毒介导的人信号肽-TNFα-Tumstatin45-132融合基因转染MSC有望成为治疗人前列腺肿瘤的辅助手段。更多还原