针对HBVⅩ基因区三个关键位点的反义寡核苷酸体内抑瘤研究

【作者】 刘素侠； 曹英林； 张利宁； 马春红； 丁培芳； 孙汶生；

【机构】 山东大学医学院医学免疫学研究所；

【摘要】 目的X基因区为乙型肝炎病毒(HBV)的重要开放读码框之一,其编码蛋白HBx具反式激活作用,X基因的整合与肝细胞肝癌密切相关。本实验室的前期工作表明,针对HBV基因区的三个关键位点-X基因翻译起始区(Xp)、顺向重复序列DR2、增强子ENⅡ的反义寡核苷酸(as-Xp、as-DR2、as-ENⅡ)具有良好的体外抗病毒作用。本课题进一步研究此三种反义寡核苷酸以一次性作用方式在体内对人肝癌裸鼠模型的抑制瘤细胞生长及抗HBV抗原表达作用。方法PCR分别合成了as-Xp、as-DR2、as-ENⅡ及无关对照序列,进行硫代化修饰,以HBV DNA转染的HepG22.15细胞5×10~6接种BALB/C-nu裸鼠,24h内同部位一次性用药100μg,观察并记录三种反义硫代寡核苷酸及对照序列作用的裸鼠的出瘤时间、出瘤率及瘤体生长情况。ELLSA法检测反义核酸作用裸鼠血清中HBsAg和HBeAg含量的变化,每份血清标本均设3个复孔,结果取平均值,对病毒抗原的抑制率由下述公式计算:抑制率=[(对照组P/N值-实验组P/N值)/(对照组P/N值-2.1)]×100%。P/N=标本OD值/阴性对照OD,以P/N值大于2.1为病毒抗原表达阳性。。结果结果判定标准:以于皮下触及瘤体为出瘤阳性,瘤体直径>0.5cm为成瘤阳性。HepG2.2.15细胞接种裸鼠后的第二天(24h内)同部位给药100μg,二周后无关序列对照组与生理盐水对照组在出瘤时间与出瘤率上无明显差别,出瘤率均为100%(8/8),as-Xp、as-DR2、as-ENⅡ作用二周后的出瘤率均为0(0/8),4周后出瘤率分别为25%(2/8)、12.5%(1/8)、25%(2/8),且瘤体生长缓慢,6周后出瘤率分别为75%(6/8)、50%(4/8)、62.5%(5/8),8周后均全部出瘤。as-Xp、as-DR2、as-ENⅡ各作用组间对裸鼠出瘤的影响无显著性差异(P>0.05)。此结果显示,as-Xp、as-DR2、as-ENⅡ一次性用药方式可抑制瘤细胞生长,表现为出瘤潜伏期延长,出瘤率明显低于未用药瘤细胞对照组(P<0.05),且瘤体生长缓慢。互补于Xp、DR2、ENⅡ区的反义寡核苷酸一次性给药方式对荷瘤鼠HBsAg和HBeAg的表达无明显抑制作用;无关序列不影响荷瘤鼠瘤体生长及HBV抗原表达。反义核酸作用的裸鼠,其饮食、活动均正常,生活习性无明显改变。取裸鼠心脏、肝脏和肾脏做病理切片,没有观察到明显的病理损伤性改变,说明反义寡核苷酸药物对裸鼠无毒。结论针对HBV Xp、DR2、ENⅡ区等关键部位的反义寡核苷酸可抑制荷瘤裸鼠人肝癌的生长,为HBV相关肝细胞癌的基因治疗提供实验依据。更多还原