pIRES-CRT/E2-SLC真核表达质粒的构建、表达的实验研究

【作者】 李丹莉； 张昌菊； 柳长柏；

【机构】 三峡大学医学院免疫学教研室； 三峡大学分子生物学研究所；

【摘要】 目的:为研究针对与人宫颈癌高度相关的18型人乳头瘤病毒(Human PapiUomavirus, HPV)的高效治疗性基因疫苗,我们将钙网蛋白(Calreficulin,CRT)基因 HPV18 E2融合, 并联合次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid-tissue Chemokine,SLC),构建了宫颈癌 DNA 基因疫苗的重组基因表达载体 pIRES-CRT/E2-SLC,检测分析其在真核细胞中的表达。方法:以 pDsRed2-N1-SLC 为模板,利用 PCR技术获得 SLC 基因片断,插入到 pIRES 载体的多克隆位点 B 中;以 pCDNA3-CRT 和 HPV18 genome DNA 为模板,利用 PCR 技术分别获得 CRT 和 HPV18E2 基因片断,将 CRT 和 E2插入到 pIRES-SLC 载体的多克隆位点 A 中。获得重组 CRT/E2融合基因联合 SLC 的真核双表达质粒 pIRES-CRT/E2-SLC。同时构建真核表达质粒 pIRES-E2、pIRES-CRT/E2以及 pIRES-CRT 等作为实验对照。使用 Iipofectamine 2000转染试剂将上述重组质粒分别转染人脐静脉内皮细胞株 ECV,RT-PCR 及 Western Blot 方法鉴定目的基因的表达。结果:获得 pIRES-CRT/E2-SLC 等基因重组表达质粒,经酶切鉴定及核酸序列分析证实己成功构建含重组目的基因真核表达质粒。RT-PCR 及 Western Blot 证实目的基因在真核细胞中的正确表达。结论:正确构建真核表达质粒 pIRES-CRT/E2-SLC, 为下一步研制高效的抗宫颈癌基因疫苗提供了必要的实验基础。更多还原