α-乳白蛋白错误折叠和形成有益生物学功能的分子机制

【作者】 杨芳(小)； 张旻； 周兵瑞； 陈杰； 梁毅；

【机构】 武汉大学生命科学学院结构生物学实验室；

【摘要】 蛋白质是生命体内各种功能的执行者,而蛋白质的结构是其功能的基础,因此研究蛋白质结构与功能关系,可以帮助我们认识各种复杂的生命现象。蛋白质错误折叠和聚集被认为引发多种人类疾病。在体内,聚集形成的原因可能是蛋白质在正常或胁迫条件下逃逸了分子伴侣和蛋白水解酶的监控而造成"质量失控"的结果,也有可能是发挥某种有益生物学功能的需要。研究表明,除了与疾病相关的蛋白质以外,非致病蛋白质也可以形成淀粉样纤维并同样具有细胞毒性。α-乳白蛋白是溶菌酶家族的蛋白质成员,其结构与溶菌酶非常相似,是研究蛋白质折叠和错误折叠的一个模型蛋白,并且该蛋白可以结合多种脂肪酸,特别是部分去折叠的去钙离子α-乳白蛋白与油酸结合,形成具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡活性的复合物 HAMLET。我们综合运用硫黄素 T 荧光染色、圆二色、原子力显微和电喷雾离子化-飞行时间质谱等技术研究了油酸对非致病蛋白质—去钙离子牛α-乳白蛋白(apo-BLA)在不同 pH 条件下形成淀粉样纤维的影响。实验结果表明,pH 诱导该蛋白去折叠,形成两个部分折叠中间体:一个是熔球态(pH 2.0-3.0),另一中间态位于中等酸度 pH 4.0-4.5,具有比熔球态结构紧密和部分去折叠的构象,有少量的疏水基团暴露。我们的研究发现,在 pH 4.0-4.5范围内,油酸特异性地抑制该蛋白形成淀粉样纤维,而且该抑制作用发生在延滞期的早期而不是延伸期。然而,油酸对于其它 pH 范围内的去钙离子α-乳白蛋白淀粉样纤维的形成没有明显的影响。进一步的实验表明,油酸特异性地诱导位于 pH 4.0-4.5的折叠中间态产生分子间相互作用生成非纤维样聚集体。在该 pH 范围内,油酸能诱导该蛋白分子在淀粉样纤维生长的早期阶段,形成非纤维样聚集体,从而阻止了淀粉样纤维的生成。除油酸以外,其它脂肪酸如亚油酸和硬脂酸也能够在37℃以时间和浓度依赖的形式诱导中等酸度条件下的折叠中间态形成非纤维样聚集体。然而,天然态和熔球态的α-乳白蛋白不能被脂肪酸诱导形成聚集。我们将这些聚集体在37℃溶解到中性缓冲液中,然后采用内源荧光、ANS 结合、远紫外圆二色、ESI-TOF 和 MALDI-TOF 质谱技术来检测其结构特征。溶解后的聚集体具有很强的 ANS 结合能力,内源荧光也有明显的红移,这说明此时的蛋白质处于部分去折叠的构象,具有暴露的疏水基团。圆二色光谱的实验结果表明其二级结构特征与天然态的相似。质谱实验的结果显示,溶解后的聚集体以单体和多聚体的混合形式存在。特别是,细胞活力检测实验表明,不饱和脂肪酸如油酸和亚油酸诱导的聚集对肺癌细胞具有非常明显的毒性,但饱和脂肪酸如硬脂酸诱导的蛋白质聚集体对细胞活力却没有明显的影响。这些具有肿瘤细胞毒性的蛋白质聚集体与能够特异诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质复合物— HAMLET 具有非常相似的结构特征,因此我们推测位于中等酸度条件下的α-乳白蛋白折叠中间态可能参与了 HAMLET 的形成。不同折叠状态的α-乳白蛋白发挥不同的生物学功能: 天然结构的蛋白具有调节乳糖合成的功能;熔球态结构更易于形成淀粉样纤维;而中等酸度条件下的折叠中间态可能参与有益生物学功能的形成。这表明不同的折叠构象有可能赋予同一条蛋白质多肽链不同的生物学功能,深化了我们对蛋白质结构与功能关系的认识。更多还原