植物内生细菌BCM2产杀线虫分泌蛋白的研究

【作者】 陈雅丽； 张磊； 闫淑珍；

【机构】 南京师范大学生命科学学院,江苏省微生物与功能基因组学重点实验室；

【摘要】 植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,不仅能吸取寄主营养和造成植物组织机械损伤还能产生分泌物和唾液破坏植物的正常代谢,影响生长和发育从而使植物产量减少品质下降,甚至死亡和绝产。国内外防治植物寄生线虫的主要方法是化学药剂的使用,但由于其残留的环境污染问题以及人们环保意识的增强,其使用受到限制,因此需要开发和利用新型安全高效生物杀线虫剂。植物内生细菌定殖于植物体内部,特别是大量定殖在植物根部,内生细菌定殖的生态位点与根部线虫相同,因此筛选植物内生细菌为生防植物寄生线虫的资源,并研究其杀线虫机理具有重要意义。采用从植物根内分离内生细菌,以松材线虫为靶标,采用直接触杀法筛选活性菌株,其中植物内生细菌菌株BCM2具高效杀线虫活性,对活性菌株进行形态学和生理生化以及16SrDNA鉴定,将菌株BCM2摇瓶发酵48h后,取发酵液8000rpm离心10min后取上清液过0.22μm滤膜去除残余菌体后取发酵滤液做硫酸铵分级沉淀,测定杀线虫活性最高的沉淀经透析除盐后取5mL透析液过葡聚糖凝胶SephadexG-75惰性柱纯化BCM2菌株的杀线虫活性成分,洗脱液为5mM pH8.0 Tris-Hcl缓冲液,流速为0.1mL/min,收集洗脱液并测定各个洗脱液的杀线虫效果。制备5%浓缩胶和12%分离胶的不连续聚丙烯酰胺凝胶,取具有杀线虫效果的洗脱液用SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量并鉴定纯度。结果从112株植物内生细菌筛选到8株内生细菌发酵上清液12h杀线虫率达到100%,16SrDNA鉴定BCM2与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)序列同源性达到99%,经形态学和生理生化鉴定其属于蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。菌株BCM2发酵滤液经硫酸铵分级沉淀其杀线虫活性随着硫酸铵饱和浓度的增加而增加,其中硫酸铵饱和浓度为70%时杀线虫效果最好,12h杀线虫效果达到92.55%;过葡聚糖凝胶层析柱获得有活性组分12h杀线虫效果为40.32%。SDS-PSGE凝胶电泳显示为一条带,其分子量为48kD。因此,初步判断活性菌株BCM2产生的杀线虫物质是一个48kD的蛋白物质,对于该菌株产生的活性蛋白物质的成分和性质及作用需进一步的研究。更多还原