内耳毛细胞分化过程中的关键基因Atoh1的下游调控因子

【作者】 钟超； 黄晓；

【机构】 浙江大学生命科学学院细胞与发育生物学研究所；

【摘要】 柯蒂氏器是位于哺乳动物耳蜗内的高度特化的感觉上皮,由毛细胞和支持细胞组成。其中毛细胞负责将机械刺激转化为神经信号,进而通过听神经传导至大脑产生听觉。听觉毛细胞的不可逆损伤是造成感音神经性耳聋的重要原因。碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Atohl是内耳毛细胞分化所必需的关键因子,它通过作用于下游靶基因从而启动内耳毛细胞的分化。因此,研究内耳毛细胞发育过程中Atohl调控的下游靶基因,阐明内耳毛细胞分化的分子机理对于感音神经性耳聋的治疗具有重要意义。通过分析小鼠小脑颗粒神经元前体细胞(CGP)的Atohl CMP-Seq以及基于FACS和RNA-Seq的小鼠内耳细胞特异性基因表达谱数据,我们发现Neurod6很可能是内耳毛细胞分化过程中Atohl直接调控的靶基因。ICR小鼠(新生1天)耳蜗感觉上皮的整体免疫荧光显示,Neurod6在听觉毛细胞当中特异性表达。分析Neurod6的启动子序列,共发现了4个高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子作用的靶序列E-box(CANNTG),其中含有两个Atohl特异结合的AtEAM(Atohl E-Box Associated Motif)。将包含这4个E-box在内的高度保守的序列(582bp)构建至EGFP报告载体上,然后转染能够内源性表达Atohl的HEK293T细胞,48h后观察到明显的绿色荧光,表明该段序列具有启动子活性。构建Atohl碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域与engrailed repressor的融合表达载体Engrailed-AtohlbHLH domain,与上述具有Neurod6启动子活性的EGFP报告载体Neurod6 promoter EGFP共转染HEK293T细胞,48h后观察荧光,结果显示,与对照组只转染Neurod6 promoter EGFP报告载体相比,共转染实验组的绿色荧光强度明显减弱,说明Atohl bHLH结构域能够特异性的结合到含E-box的Neurod6的启动子上。更多还原