整合子中氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶多克隆抗体的制备与初步应用

【作者】 魏取好； 胡庆丰； 吕火祥； 周永列； 蒋晓飞； 李敏； 吕元；

【机构】 浙江省人民医院检验中心； 复旦大学上海医学院附属华山医院检验医学科；

【摘要】 目的制备氨基糖苷-3″-腺苷酰基转移酶(aminoacyl-3″-adenylyltransferase,AAD(3″))特异性抗血清,并用以检测第1类整合子不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的表达水平。方法 PCR扩增aadA2基因并克隆至表达载体pET19b中,诱导表达并纯化带组氨酸标签的重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔制备抗AAD(3″)特异性抗血清。以制备的抗AAD(3″)抗血清为一抗,Western blotting检测不同可变区启动子下游基因盒中aadA2基因的翻译水平,微量肉汤稀释法检测链霉素对含不同可变区启动子及其下游aadA2基因盒的大肠埃希菌JM109的最小抑菌浓度。结果本研究成功构建重组AAD(3″)蛋白表达质粒pET19b-aadA2,转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导获得高表达可溶性重组AAD(3″)蛋白的工程菌株,发酵后用镍柱纯化重组AAD(3″)蛋白免疫大耳白兔获得效价>1:100,000的抗AAD(3″)特异性抗血清。不同可变区启动子下游aadA2基因的表达水半明显不同,启动子PcS-P2下游aadA2基因的表达水平最高,PcW下游的表达水平最低,赋予宿主菌对链霉素的耐药水平可相差64倍。结论本研究成功纯化出可溶性重组AAD(3″)蛋白,免疫大耳白兔获得高效价的抗AAD(3″)特异性抗血清,为进一步研究整合子中整合酶基因与可变区基因盒表达之间的相互关系奠定基础。不同可变区启动子下游的耐药基因盒的表达水平明显不同,即赋予宿主细菌不同的耐药水平,因此在对临床菌株进行第1类整合子分子流行病学调查时应重视可变区启动子分类方面的研究。更多还原