VEGF165基因腺病毒载体的构建及其体外表达

【作者】 吕海涛； 孙凌； 贾红亮； 谢宇锋； 杨吉成； 盛伟华；

【机构】 苏州大学附属儿童医院心内科； 苏州大学基础医学系细胞与分子生物教研室；

【摘要】 目的拟构建携带血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因的腺病毒载体,并观察转染靶细胞后目的基因的表达水平。方法（1）通过PCR法以pSV-K3-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV质粒上,构建重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165,行PCR、酶切和DNA测序鉴定;（2）将重组转移质粒pAdTrack-CMV-VEGF165行PmeⅠ线性化与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,琼脂糖电泳获得重组腺病毒质粒pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-VEGF165,PCR、单酶切鉴定。（3）将同源重组腺病毒质经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-VEGF165,并测定效价。（4）腺病毒Ad-VEGF165体外表达的鉴定:Ad-VEGF165转染QBI-293A细胞。GFP表达、RT-PCR鉴定VEGF165基因的表达,ELISA定量检测VEGF165蛋白的表达水平。结果PCR、双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pAdTrack-CMV-VEGF1 65重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达;经扩增、纯化后,病毒效价可达2×10¹⁰pfu/ml滴度。转染48 h后,293A细胞中的血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93,17.93,P<0.05）。结论成功构建并获得携带VEGF165基因的腺病毒载体,并实现在靶细胞QBI-293A中有效表达,为VEGF165基因修饰干细胞的应用研究奠定基础。更多还原