精子差异蛋白质谱分析父源性受精关键蛋白的研究

【作者】 朱勇； 吴亦波； 刘锋； 郭雪江； 郭曰帅； 闫锋； 刘勇； 曹小蓉； 胡洪亮； 沙家豪南京医科大学国家生殖医学重点实验室； 周作民； 李铮；

【机构】 南京医科大学国家生殖医学重点实验室； 上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科上海市男科学研究所精子发育与遗传学实验室上海市人类精子库；

【摘要】 目的:通常采用两种方法来筛选功能相关的分子,即高通量的mRNA差异表达芯片和蛋白质谱分析技术。前者通过对mRNA转录水平的分析,可以来研究与生育力密切相关的转录水平上调或下调。而蛋白质谱技术,是鉴定蛋白或肽段分子入手,选择与生育力相关的精子蛋白,进行定性或定量的分析,最后筛选潜在的蛋白分子标志物。本研究利用液相色谱结合定量质谱技术,鉴定高生育力和低生育力者精子的差异蛋白谱,寻找临床预测男性生育力的关键蛋白分子。资料与方法:分别选取供精IVF和AID供精反馈后,高生育力(辅助生殖周期<8个,临床妊娠=5)和低生育力(辅助生殖周期>10个,无临床妊娠)捐精者各3例。捐精者均来自上海交通大学医学院附属仁济医院、上海市人类精子库。精液参数与冷冻复苏率完全符合中华人民共和国卫生部人类精子库基本标准和技术规范,冷冻前精液浓度>10×10~6,存活率大于60%,前向运动比率大于60%,冷冻复苏率大于60%。用同量异位素分别标记后,采用液相色谱分离蛋白质,结合质谱进行肽段鉴定,并经Western Blot验证,统计分析关键差异蛋白以及生物信息学分析。结果:6个质谱分析的样本(3:3=高生育力:低生育力)分别鉴定的蛋白总数为:2,057、2,067、2,063、2,061、2,062、2,060,去除冗余蛋白后,共鉴定出2,045种蛋白质。其中两组差异显著性蛋白21个(倍数变化>1.2倍,t检验的p-value<0.05),其中低生育力者高表达蛋白有4个(B2M、PPP5C、GSN、PFKM),其它皆为高生育力者高表达蛋白。共鉴定差异蛋白21个,4个蛋白在低生育力者高表达,其它皆在高生育力者高表达。这些差异蛋白主要参与细胞的有丝分裂、凋亡、精子发生以及受精和胚胎发育等重要细胞活动。结论:同位素标记的相对定量质谱技术是近年来新的技术革新,它通过用质量较小的同位素(113-121)作为报告离子,从而使蛋白样品中的小分子和低丰度蛋白更好的分辨和鉴定。本研究采用的差异蛋白组研究方法 ,比较生育力高低的精子蛋白组,发现父源性关键受精蛋白,为研究受精和胚胎发育机制以及临床开发预测男性生育力的蛋白标志物提供理论基础。更多还原