GST pull-down实验检测人P65和SMRT蛋白间相互作用

【作者】 王春美； 盛光耀； 刘玉峰； 王颖超； 谢垒；

【机构】 郑州大学第一附属医院；

【摘要】 目的采用GST pull-down实验检测人P65和SMRT蛋白间是否存在相互作用。方法采用PCR扩增人P65基因全长CDS区和SMRT基因2312-2525aa对应的目的基因片段,酶切、测序鉴定正确后,分别连接至pET-32a和pGEX-6p-1原核表达载体上;然后将获得的原核表达质粒转化工程菌E.coli BL21,经IPIG诱导表达后,进行蛋白纯化;GST、GST-SMRT融合蛋白与His-p65蛋白经GST pull down后直接进行SDS电泳,并分别采用anti-GST单抗和anti-His单抗进行Western Blot分析。结果酶切及测序结果表明,PCR扩增的P65基因全长CDS区和SMRT基因2312-2525aa对应的碱基序列完全正确;成功构建了人P65和SMRT蛋白原核表达载体pET-32a-p65和pGEX-6p-1-SMRT:在工程菌E.coli BL21,1.0mM IPTG即可得到一定量的蛋白表达,以诱导6h表达的蛋白量最佳;经anti-GST抗体Western Blot检测,GST蛋白及GST-p65融合蛋白均有特异的杂交反应,采用anti-his单抗进行Western Blot分析表明,GST-SMRT蛋白pull down后的洗脱液及直接输出的His-p65融合蛋白均可检测到目的条带,而GST蛋白、GST-SMRT融合蛋白及GST蛋白对照组pull down后的洗脱液检测不到条带。结论成功构建了人P65和SMRT蛋白重组原核表达载体,GST pull-down实验证实二者间存在相互作用,为体内进一步探讨儿童AML发病机制和白血病的靶向治疗提供理论依据。更多还原