丙型肝炎核心蛋白基因的克隆及原核表达

【作者】 黄茜； 张仁利； 耿艺介； 黄达娜； 高世同； 胡章立；

【机构】 深圳市疾病预防控制中心分子生物室；

【摘要】 目的构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中表达HCV核心蛋白全长基因。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,以获得核心蛋白全长基因。将纯化的PCR产物插入pGEM-T Easy克隆载体中,经HindⅢ、BamHⅠ双酶切、测序鉴定,测序结果应用BLAST在线软件分析核苷酸序列的同源性。分别用HindⅢ、BamHⅠ双酶切pGEM-T/HCVc质粒和表达载体pET-28a,将HCV核心蛋白全长基因与带有6个His标签的原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET-28a/HCVc。经HindⅢ、BamHⅠ双酶切及测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,以IPTG终浓度为1 mM,30℃、180r/min诱导过夜,同时设阴性对照。采用SDS-PAGE电泳鉴定表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析,收集菌体沉淀,以50mM的Tris-HCl重悬,冰浴中超声破碎。超声后的沉淀和上清以及阴性对照分别取样,进行SDS-PAGE分析。采用镍离子亲和层析法,利用表达载体pET-28a上带有的His₆标签与镍离子的亲和作用纯化重组蛋白。Western-blot鉴定表达产物的抗原特异性,表达蛋白经SDS-PAGE后直接电转印到PVDF膜,封闭、漂洗后,鼠抗His标签单克隆抗体（1:2000稀释）、HRP标记的羊抗鼠IgG酶标二抗（1:2000稀释）,以DAB染色观察结果。结果PCR扩增获得573bp的HCV核心蛋白全长基因,HindⅢ、BamHⅠ双酶切及测序表明,重组表达载体pET-28a/HCVc构建成功。经IPTG诱导后,表达重组菌经12%SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约21kD处出现明显的特异条带,与预期的融合蛋白大小一致。可溶性分析显示,重组蛋白以包涵体形式存在。Western-blot结果显示目的纯化回收的融合蛋白可与抗His单克隆抗体反应,在相对分子质量约21kD处呈现一条特异性的反应条带,证实重组蛋白具有良好的HCV抗原特异性。结论HCV核心蛋白全长基因成功表达,为进一步研究HCV C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用打下坚实的基础。为本研究后续试验,即HCV全长核心蛋白在人肝癌细胞株内的表达和定位的研究,探明HCV C蛋白与p53蛋白在核内的结合情况及探索HCV C蛋白对mdm2、p14、p53、p21等蛋白表达的影响等做好了前期准备,为下一步关于HCV核心蛋白与HCV持续性感染及致癌机制的深入研究提供了重要的实验依据。对深入认知和分析HCV C蛋白分子生物学特性,初步探索HCV C蛋白与宿主细胞蛋白因子相互作用,以及对阐明HCV持续性感染与致癌机制以及HCV对肝细胞脂肪化与干扰素疗效的影响等诸多问题具有重要意义。更多还原