单核细胞增生性李斯特菌PCR诊断方法的建立

【作者】 张杰； 骆学农； 郑亚东； 伏小平； 朱小玲；

【机构】 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室； 甘肃农业大学动物医学院；

【摘要】 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是李斯特菌属的重要成员,作为一种重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共卫生学上有重要意义,如何找到一种快速、敏感特异、合理的检测方法 ,是各国卫生部门目前亟待解决的问题之一。目前传统单核细胞增生性李斯特菌国标检测法(FDA方法、USDA法、IDF法)具有良好的科学性、重复性,适合我国基层实验室使用能满足食品卫生监督检验的需要,但全过程需时至少6～7d,才能得出明确的诊断结果。因此,在需要及时、快速评价食品中微生物安全性时,通常不被采用。本研究利用分子生物学手段,检测产单核细胞李氏杆菌核酸无须进行分离、生化反应、动物试验,可将检测时间从原来的一周缩短到1d。溶血素O基因(hlyA基因)是单核细胞增生性李斯特菌最重要的毒力基因,它存在于所有的致病性单核细胞增生性李斯特菌中。鉴于此本研究根据GENBANK上发表的单核细胞增生性李斯特菌的hly基因序列进行分析比较,设计特异性引物,扩增hly基因的高度保守的部分片断,预计扩增片断的长度为722bp,建立PCR检测方法①按下列组分配制PCR反应液:模板DNA,1μl;10×PCR Buffer,3μl;2.5mMdNTP Mixture,2μl;上、下游引物(50pmol/μl)各1μl;Taq酶,0.5μl;灭菌无离子水,补至总体积25μl。混匀后置于PCR仪中②按下列条件进行PCR反应:95℃预变性5min后,进行如下循环:94℃,1min;51℃,1min;72℃,1min,35个循环,最后72℃再延伸5min。扩增完成之后,取PCR产物5μl用1.0%的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)电泳,确认PCR扩增产物。如样品检测出722bp的目的片断,可判定为阳性结果 ;如未检测出722bp目的片断,可判定为阴性。在PCR方法建立的同时进行了敏感性试验、特异性试验、干扰性试验及稳定性试验,试验结果表明该方法的敏感性为10~4cfu/ml,具有较好的敏感性。本试验用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌检测该方法的特异性,结果表明只有单核细胞增生性李斯特菌能扩增出目的片断;同时用上述菌进行干扰试验,敏感性仍能达到10~4fu/ml,结果表明该方法不受其它菌的干扰。此方法经过多次验证,效果非常稳定,具有很好的使用价值。更多还原