大鼠CTGF miRNA质粒载体构建及其稳定转染肝星状细胞系的建立

【作者】 李孝生； 阳宏； 向颖； 邢旎旎； 沈艳；

【机构】 重庆医科大学附属第二医院消化内科；

【摘要】 目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)基因miRNA质粒载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,获得CTGF miRNA质粒稳定转染大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的细胞系。方法:根据大鼠CTGF基因mRNA序列设计并合成3对寡聚单链DNA及1对阴性对照序列DNA,将3对寡聚单链DNA及1对阴性对照序列DNA退火成双链分别插入到质粒载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成CTGF基因miRNA表达的3个质粒及一个阴性质粒。4种质粒分别转染肝星状细胞,经RT-PCR检测4种质粒对CTGF基因的干扰效率并筛选出干扰效率最高的质粒。将干扰效率最高的质粒及阴性质粒分别转染肝星状细胞,经杀稻瘟菌素持续压力筛选稳定转染的细胞克隆。结果和结论:成功构建了CTGF基因miRNA表达质粒载体,筛选出干扰效率最高的质粒载体并稳定转染肝星状细胞,为进一步研究肝纤维化的形成机制及治疗奠定了坚实的前期基础。更多还原