乙肝病毒颗粒通过Toll样受体信号转导通路促进Kupffer细胞分泌TGF-β1

【作者】 彭真； 贾继东；

【机构】 首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心；

【摘要】 背景和目的:在我国慢性乙型肝炎是引起肝纤维化的主要病因,多数学者认为乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的纤维化与肝脏内炎症及免疫机制相关,但到目前为止HBV导致肝纤维化的具体发病机制还不明确。肝脏Kupffer细胞是构成肝脏天然免疫最大的一群细胞,最近研究表明,Kupffer细胞不仅对肝脏的炎症有重要的介导作用,还对肝脏纤维化形成和消散具有重要的调节作用。但尚无研究报道HBV对Kupffer细胞对纤维化调控功能是否具有影响,一些应用间接方法研究的结论也存在矛盾之处。因此,本研究通过体外实验,分离纯化原代大鼠Kupffer细胞以及HBV颗粒,初步探讨乙肝病毒对Kupffer细胞功能的影响及机制。材料和方法:应用两步胶原酶灌流,密度梯度离心,磁珠分选和2小时选择性贴壁方法分离纯化大鼠肝脏Kupffer细胞,采用MTT法观察HBV对Kupffer细胞增殖率的影响。应用流式细胞仪和细胞荧光染色技术来鉴定和了解Kupffer细胞的纯度。收集乙肝患者的高滴度血清,经蔗糖密度梯度离心提取得到纯化HBV,按照浓度梯度0 Log IU/ml,4 Log IU/ml,6 Log IU/ml刺激分离纯化的原代大鼠肝脏Kupffer细胞。收集纯化HBV刺激Kupffer细胞基线和每12或24小时上清,应用ELISA方法检测促炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平以及促纤维化因子TGF-β1水平,收集HBV刺激24小时、48小时和72小时的Kupffer细胞的mRNA和蛋白,应用实时荧光定量PCR方法检测细胞TGF-β1、IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,及TLR1-9的mRNA表达水平,应用western blot方法检测细胞内TGF-β1蛋白表达水平。运用检测到升高的TLRs的抑制剂抑制其功能,ELISA检测受到抑制后TGF-β1水平变化。结果:蔗糖密度梯度离心法可得到高滴度高纯度的HBV颗粒,其HBV DNA升高,HBsAg下降,HBeAg消失。每只大鼠肝脏可分离约1×10~8大鼠原代Kupffer细胞,经磁珠分选及贴壁后可收获约1×10~7纯化细胞,细胞纯度近90%。HBV刺激Kupffer细胞的3天中TGF-β1在培养上清中的表达明显升高,且和HBV剂量有关,6 LogIU/ml HBV组TGF-β1升高最为明显,和基线相比分别在12小时、24小时和72小时升高至881.600±66.868,393.600±65.401,431.408±221.075pg/ml;Kupffer细胞内的TGF-β1表达在高滴度HBV刺激后第24小时(HBV 6 Log IU/ml:307.704±14.323)和第72小时(HBV 6 Log IU/ml:464.018±34.035)也呈升高表现;而且,高滴度HBV刺激组Kupffer细胞TGF-β1表达(western blot,n=5,P=0.000)和分泌(ELISA,n=5,P=0.000)的升高程度明显高于4 Log IU/ml HBV和对照组。在高滴度刺激组24小时的Kupffer细胞mRNA中检测到TLR2(11.402±1.846)、4(44.392±4.737)、TLR7(12.750±2.058)和TLR9(4.518±1.427)明显升高,而在72小时仍可检测到TLR2(10.339±1.070)的升高。同时检测炎症因子IL-1(n=5,F=2.671,P=0.110)、IL-6(n=5,F=0.877,P=0.441)、IL-10(n=5,F=1.290,P=0.311)和TNF-α(n=5,F=0.666,P=0.532)上清表达水平,发现这些炎症因子和对照组相比也没有明显升高。运用TLR2、4抑制剂OxPAPC刺激24小时及72小时,和对照组相比,抑制剂组TGF-β1均受到抑制(ELISA,n=3,P<0.01),TLR7、9抑制剂Pepinh-MYD刺激24小时,和对照组相比,也可抑制TGF-β1的表达(ELISA,n=3,P<0.01)。结论:HBV刺激的大鼠原代Kupffer细胞通过Toll样受体信号传导通路促进TGF-β1分泌。更多还原