肠道病毒71型重组VP1蛋白的表达和EV71型手足口病血清学诊断方法的建立

【作者】 周伯平； 刘威龙； 谢靖婧； 陈心春； 徐六妹； 谭艳； 刘映霞； 杨桂林；

【机构】 深圳市东湖医院；

【摘要】 目的:获得纯化的具有免疫活性的肠道病毒71型VP1蛋白,建立EV71感染早期、快速和准确的ELISA血清学诊断方法。方法:利用PCR方法扩增出VP1目的基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-21b（+）,阳性质粒经过双酶切分析和序列测定鉴定含有目的基因VP1,构建好的新质粒命名为PET-21b:VP1。将该质粒转化入E.coli BI21（DE3）感受态细胞,通过IPTG诱导进行蛋白表达,当OD值达到约1.5后收集细菌培养液,超声仪破碎细菌,14000rpm×10min离心后,收集上清和细菌团块,通过SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹分析上清和细菌团块中目的蛋白的表达水平;用His·Bind^TM柱亲和层析法纯化融合蛋白。纯化的VP1蛋白用作包被抗原,建立手足口病（HFMD）患者抗-EV71-IgM和IgG的血清学诊断方法。结果:成功扩增出目的基因VP1片段,构建了重组表达质粒PET-21b:VP1,SDS-PAGE显示表达的重组蛋白分子量约为35kD,与VP1分子量大小相符,经亲和层析纯化后的VP1重组蛋白纯度良好,且能被抗His-tag抗体和EV71型手足口病患者血清所识别。调查发现,与正常人和EV71阴性手足口病患儿比较,EV71阳性手足口病血清中抗-EV71-IgM和IgG中OD值显著升高,差异具有显著性意义（p<0.05）。将EV71阳性患者抗-EV71-IgM和IgG OD值绘制ROC曲线,并与RT-PCR结果比较,发现IgM的诊断敏感性和特异性分别为73%和77%;该IgG诊断方法的敏感性和特异性别为82%和83%。完成该试验仅需4小时。结论:利用pET原核表达系统成功克隆、表达和纯化了肠道病毒71型重组外壳蛋白VP1,且具有良好的抗原性。该抗原可用于研制EV71血清学诊断试剂盒。更多还原