Nrf2-ARE通路在大鼠心肌细胞缺氧/乳化异氟醚后处理中作用的研究

【作者】 李小娟； 王海英；

【机构】 遵义医学院附属医院麻醉科；

【摘要】 目的建立成年SD大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型,观察缺氧/乳化异氟醚(EI)后处理对大鼠心肌细胞的影响,以Nrf2为靶点,探讨核因子相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)通路在缺氧/El后处理心肌保护中的机制,以及药物后处理替代缺氧后处理的可能性。方法 1.通过Langendorff灌注离体心脏,分离、培养成年大鼠心肌细胞,建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型,将心肌细胞随机分为7个组,正常组(N组)、对照组(C组)、缺氧后处理组(IPO组)、EI不同浓度后处理组(0.84、1.68、2.52)mmol/L,EI1,E12,EI3组)和脂肪乳处理组(FAT组)。分离后的心肌细胞培养20h,除N组持续培养110 min,其余各组均缺氧45 min,复氧60 min。IPO组缺氧45 min后缺氧、复氧重复3次,每次各5 min,在继续复氧60 min;EI1、EI2和EI3组缺氧45 min后分别以(0.84、1.68、2.52)mmol/L EI处理5 min,复氧60 min;FAT组缺氧45 min后分别以脂肪乳处理5 min,复氧60 min。2.透射电子显微镜观察缺氧复氧损伤后的心肌细胞超微结构并对其进行线粒体评分。3.Real-Time PCR及Western blot技术检测复氧末心肌细胞中Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01的基因mRNA表达及蛋白质表达情况。4.荧光共聚焦显微镜下观察复氧末心肌细胞内钙离子水平及Nrf2核转位。结果 1.电镜结果显示N组心肌细胞超微结构正常,C组超微结构损伤严重,IPO组、不同浓度EI组、均优于FAT组和C组,但IPO组、EI2组优于EIl组和EI3组,FAT组稍优于C组;线粒体评分结果与心肌细胞超微结构结果变化趋势一致。2.Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01 mRNA表达量:与N组相比,其它各组Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01基因mRNA表达量明显降低(P<0.05);与C组相比,其它各组基因mRNA表达量显著增高(P<0.05);其中IPO和EI2组基因rnRNA表达量显著高于EI1和EI3组(P<0.05);EI1和EI3组Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01的基因mRNA表达无显著差异(P>0.05),FAT组mRNA表达量高于C组(P<0.05)。3.Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01蛋白质表达量:与N组相比,其余各组Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01蛋白表达量明显降低(P<0.05);与C组相比,其余各组蛋白表达量增高(P<0.05);其中IPO和EI2组Nrf2、HO-1、SODl、和NQ01蛋白质表达量显著高于EI1和EI3组(P<0.05);IPO与EI2组蛋白表达无明显差异(P>0.05);FAT组蛋白表达量高于C组(P<0.05)。4.荧光共聚焦显微镜检测心肌细胞内钙离子:与N组比较,其它他各组荧光强度增强(P<0.05);与C组比较,其它各组荧光强度明显减弱(P<0.05),其中IPO和EI2组荧光强度明显低于EIl和EI3组(P<0.05),IPO与EI2两组比较差异不显著(P>0.05),FAT组荧光强度低于C组(P<0.05)。5.荧光共聚焦显微镜观察细胞内Nrf2的亚细胞分布。在不同的实验组有明显改变,N组心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度低;C组与N组比较心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度增强(P<0.05);与C组比较,IPO组及EI组心肌细胞核内Nrf2蛋白荧光强度显著增强(P<0.05);其中IPO组和EI2组核内Nrf2蛋白荧光强度明显高于EIl和EI3组(P<0.05),IPO与EI2组比较,核内Nrf2蛋白荧光强度差异不显著(P>0.05),FAT组细胞核内Nrf2蛋白荧光强度高于C组(P<0.05)。结论 1.缺氧复氧对原代培养的成年大鼠心肌细胞可以造成明显损伤,缺氧、EI、脂肪乳后处理均能改善缺氧心肌细胞功能,与脂肪乳相比,缺血、乳化异氟醚后处理具有更确切的心肌保护作用2.缺氧、不同浓度EI后处理均可激活Nrf2及其下游抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因mRNA的表达,从而发挥心肌保护效应,而在本实验所用浓度范围中EI2(1.68 mmol/L)效果最佳。3.缺氧、不同浓度EI后处理均能减少心肌细胞内钙超载,起到保护缺氧心肌细胞的作用。4.缺氧、不同浓度EI后处理均可诱导Nrf2核转位,从而发挥心肌保护效应,激活Nrf2-ARE通路可能是EI后处理及缺氧后处理的心肌保护机制之一。更多还原