肿瘤靶向阿霉素前体药物的设计合成及其抗肿瘤活性研究

【作者】 宦梦蕾； 周四元； 张邦乐； 梅其炳；

【机构】 第四军医大学药学系药剂学教研室； 第四军医大学药学系药理学教研室；

【摘要】 目的阿霉素（DOX）在临床上主要用于治疗乳腺癌等恶性肿瘤,然而阿霉素对正常组织器官如心脏、肾脏、骨髓等具有明显的毒副作用,从而限制了其临床应用。本研究以阿霉素为研究对象,依据靶向前体药的设计思想,选择具有肿瘤靶向性的PEG大分子以及可被肿瘤细胞高度摄取的α-亚麻酸为药物载体,设计合成出具有肿瘤靶向性的阿霉素前体药物,采用体内外实验观察阿霉素前体药物的肿瘤靶向性以及抗肿瘤活性。药物设计聚乙二醇（PEG）具有无毒、无免疫原性、可与多种药物共价连接的特点,被广泛用于药物制剂及药物传递系统。由于肿瘤局部血流丰富、血管通透性增加以及单核细胞吞噬系统的吞噬能力降低,因此聚乙二醇支载的药物在肿瘤部位可增强穿透能力并产生滞留效应,更容易在肿瘤组织蓄积,使PEG支载的药物具有被动靶向作用。将阿霉素分子中3′位氨基与PEG连接,构建肿瘤被动靶向阿霉素前体药物。通常情况下,肿瘤细胞的微环境偏酸,腙键可在酸性环境中裂解。本研究选取阿霉素分子中13位的羰基通过腙键与聚已二醇（PEG）连接,构建兼有被动靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的双重靶向药物。此外,研究表明,肿瘤细胞摄取多不饱和脂肪酸的量远高于正常细胞,选择多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸（DHA）用作肿瘤靶向递药系统,明显地提高了紫杉醇的抗肿瘤活性,降低了其全身的毒副作用。本研究以α-亚麻酸为递药载体,选取阿霉素分子中3′位氨基与其连接,构建肿瘤靶向阿霉素前体药。方法在氮气保护下进行化学合成反应,反应过程用TLC监控,记录反应进度。通过高锰酸钾将PEG 6000氧化成PEG 6000二酸;通过EDCI或DCC/DMAP的催化,将α-亚麻酸（LNA）或PEG6000二酸引入阿霉素（DOX）的3′位氨基得到阿霉素和PEG或LNA的酰胺键连接物（PEG-DOX amid,DOX-LNA）。通过EDCI的催化,PEG 6000二酸与肼基甲酸叔丁酯（BOC肼）反应生成PEG 6000二酰肼（BOC保护）,去除BOC保护得到PEG 6000二酰肼;通过EDCI的催化,将PEG 6000二酰肼引入阿霉素（DOX）的13-位羰基得到阿霉素和PEG的腙键连接物（PEG-DOX hydrazone）。利用熔点仪检测目标化合物熔点,并分别进行波谱学鉴定。建立液相色谱条件,在选定的水解条件下将前药完全水解,测定阿霉素-PEG连接物的载药量,同时观察阿霉素前体药物在体外的释药性能。培养HepG-2（肝癌）、MCF-7和MDA-MB-231（乳腺癌）细胞,将待测的各种药物（DOX、DOX-LNA、PEG-DOX amid、PEG-DOX hydrazone）按设定浓度分别与上述细胞孵育一定的时间,根据阿霉素具有荧光的特点,利用荧光显微镜观察药物在细胞内的分布,同时通过流式细胞仪半定量分析细胞对药物摄取的特点。建立生物样品中阿霉素的HPLC-MS-MS检测方法,定量测定不同肿瘤细胞对不同的前体药物的摄取。采用MTT法,计算不同的药物对所选定的几种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀),评价所设计合成的几种前药的体外抗肿瘤活性。将培养至对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于裸鼠腋下,建立荷瘤动物模型,分别设立DOX阳性药组、DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone两种前体药物的大、中、小剂量和化学预防组,给予相应的处理,每天观察裸鼠的体重变化及肿瘤生长情况,测定肿瘤体积。试验结束后,处死动物,取下肿瘤组织称重,根据公式计算肿瘤生长抑制率。复制荷瘤裸鼠模型,设立DOX组、DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone两种前体药物组,给予药物后于2、8、24 h处死动物,分别检测DOX在肿瘤组织和正常组织中的含量。SD大鼠静脉给予DOX、DOX-LNA、PEG-DOX amid、PEG-DOX hydrazone 5 mg·kg^-1,0.08、0.17、0.5、1、2、4、8、12、24 h后乙醚麻醉大鼠,腹静脉采集血样（肝素抗凝）,3000 rpm离心10 min,分离血浆。于给药0.5、2、8、24 h后处死动物,取心、肝、脾、肺、肾组织,称重,匀浆备用。HPLC-MS-MS方法检测静脉给予阿霉素或其前药后,大鼠血浆和组织中阿霉素含量随时间的变化。结果DOX-LNA为暗红色粉末,熔点91℃,产率为73%。质谱测得准分子离子峰为m/z=802.8（[M-H]^-）。PEG-DOX amid为暗红色粉末,熔点82℃,产率为87%,阿霉素载药量为3.9%。PEG-DOX hydrazone为暗红色粉末,熔点78℃,产率为82.5%,阿霉素载药量为10.64%。阿霉素前体药物的体外释药研究结果显示,PEG-DOX hydrazone具有酸敏特性,在偏酸性环境中DOX释放较多,中性环境下较稳定。细胞摄取实验结果表明,PEG-DOX amid在三种细胞内蓄积量较少,DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone在三种细胞内蓄积量高于PEG-DOX amid。与阿霉素相比,DOX-LNA进入细胞的量明显增加,并具有一定的时间依赖性。HepG-2细胞对前体药物摄取的峰值最高,MCF-7细胞最低。肿瘤细胞对PEG-DOX amid及PEG-DOX hydrazone的摄取呈现时间和剂量依赖性。体外细胞毒实验结果显示,前药对HepG-2、MCF-7、MDA-MB-231细胞具有一定的细胞毒性,且呈现良好的剂量依赖性。DOX对HepG-2、MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC₅₀值分别为14.3±0.4、8.3±0.6、10.2±0.3μmol·L^-1。DOX-LNA对HepG-2、MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC₅₀值分别为6.8±0.1、4.7±0.1和3.1±0.2μmol·L^-1。PEG-DOX hydrazone对HepG-2、MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC₅₀值分别为27.2±3.4、20.6±2.3和23.8±2.6μmol·L^-1。PEG-DOX amid对HepG-2、MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC₅₀值分别为34.1±1.5、32.2±1.9和29.6±3.1μmol·L^-1。此外,大分子前药的体外细胞毒性还呈现出一定的时间依赖性,孵育时间越久,IC₅₀值越低。药效学结果显示,5 mg·kg^-1阿霉素的肿瘤抑制率为（31.1±5.3）%;1、3、10 mg·kg^-1DOX-LNA（相当于DOX的剂量）的肿瘤抑制率分别为（34.3±4.7）%、（42.5±5.9）%、（46.7±4.1）%;5、10、15 mg·kg^-1PEG-DOX hydrazone（相当于DOX的剂量）的肿瘤抑制率分别为（32.7±6.2）%、（38.6±3.2）%、（43.2±4.3）%。DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone治疗组动物体重变化与给药剂量均呈反比,给药剂量越大,动物体重增长越缓慢,而DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone化学预防组动物体重增长较其治疗组明显。荷瘤裸鼠体内分布实验显示,DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone均能增加药物在肿瘤组织的分布,降低阿霉素在正常组织尤其是心脏中的分布,具有一定的肿瘤靶向性。大鼠体内药动学实验结果表明,DOX、DOX-LNA、PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的半衰期分别为2.1、4.1、7.3和9.14 h,AUC分别为275、627、905、1519 ng·h·ml^-1。大鼠体内组织分布实验结果表明,与DOX相比,前体药物给药后,DOX在心脏中的分布减少。结论PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone能够释放出阿霉素,使DOX的半衰期明显延长,呈现缓释特性。DOX-LNA的细胞毒性高于DOX,而PEG-DOX amid和PEG-DOX hydrazone的IC₅₀高于原药。DOX-LNA和PEG-DOX hydrazone可剂量依赖性抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,降低DOX对动物体重的影响,呈现肿瘤靶向性,降低了DOX的系统毒性。更多还原