小分子p53-MDM2结合抑制剂L2的抗肿瘤作用及其机制研究

【作者】 张蕾； 刘晓文； 景慧； 杨波； 何俏军；

【机构】 浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所；

【摘要】 目的建立MDM2-p53结合抑制剂的体外筛选模型,评价以抑制MDM2-p53结合为靶点设计的nutlins类似物L2的体外抗肿瘤细胞增殖活性,采用人非小细胞肺癌A549细胞深入研究L2抑制p53-MDM2结合的活性。方法采用MTT法检测化合物L2的细胞毒性。采用PI染色结合流式细胞术检测L2对A549细胞周期分布的影响;采用Annexin v/PI染色结合流式细胞术检测L2诱导A549细胞发生凋亡的作用。采用DAPI染色观察L2诱导A549细胞产生的凋亡小体。采用Carboxy-DCFDA染色检测L2对A549细胞活性氧族（reactive oxygenspecies,ROS）含量的影响。采用免疫沉淀技术探索L2是否能阻断p53-MDM2的结合。采用免疫荧光法观察L2对A549细胞内p53蛋白分布的影响。采用Western blotting检测L2对A549细胞中MDM2、p53、p-p53、核内p53、周期相关蛋白（p21,CDC2,Cyclin B1,CDK2,CyclinE,CDK7）、凋亡相关蛋白（caspase-3,caspase8,caspase9,XIAP）及线粒体相关蛋白（Bax,Bcl-2）的影响。采用Real Time PCR技术检测p53及p21等蛋白mRNA水平的变化。结果化合物L2较nutlin-1显示出更高的体外抗肿瘤活性,而这种抗肿瘤活性相较于nutlin-1更加依赖于细胞本身的p53状态,具有更高的选择性。L2对具有野生型p53的A549及HCT116细胞的IC₅₀值分别为7.68±1.05,6.37±0.76μM,对p53突变或缺失的PC3及KB细胞的IC₅₀值分别为39.66±5.65,16.69±2.72μM。PI染色结合流式细胞术结果显示L2能够引起A549细胞发生周期阻滞,使得S期剂量依赖性地减少,并使相关的周期蛋白发生相应的变化。Annexin v/PI染色结合流式细胞术检测发现L2能使A549细胞发生凋亡,凋亡率随着剂量的增加而增加,同时DAPI染色也能明显地观察到12μM L2作用48 h后A549细胞凋亡小体的产生。Carboxy-DCFDA染色及Western blotting检测发现L2能够升高A549细胞内ROS的含量,并引起线粒体通路的蛋白Bax上调、Bcl-2下调。免疫沉淀及免疫荧光的结果显示L2能够剂量依赖性地减少和p53结合的MDM2蛋白的量,并促进p53蛋白在细胞核内的积聚。同时,Western blotting检测未发现A549细胞内p-p53蛋白的产生。另外,RealTime PCR结果显示,L2并不能引起p53蛋白mRNA水平的变化,却能引起p53的下游p21蛋白mRNA水平的增加。结论化合物L2通过阻断细胞内p53-MDM2的结合从而激活p53通路显示出了较高的体外抗肿瘤细胞增殖活性,而这种抗增殖活性依赖于细胞的p53状态具有较高的选择性,初步检测认为L2的抗增殖活性可能是源于能使细胞发生周期阻滞及凋亡。细胞内p53蛋白的累积是由于L2降低了其降解而并不是增加其表达引起的。此外,L2能够同时抑制p53蛋白的核输出,增加其转录活性。因此,L2是一个极具研究前景的小分子MDM2-p53结合抑制剂。更多还原