细胞定位表达的新城疫病毒HN基因真核重组质粒的构建和抗肿瘤作用研究

【作者】 隋红； 李曦； 张永欣； 李乐静； 白玉贤；

【机构】 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科； 中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室；

【摘要】 目的构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,初步研究它们在抗肿瘤作用中的差异和机制。方法应用现代分子生物学技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒。经脂质体转染人肺癌细胞系A549,通过MTT和WST-1检测细胞活力,流式细胞仪和电镜检测凋亡差异。皮下注射A549细胞构建荷瘤小鼠,瘤内注射三种质粒,检测三种质粒对荷瘤小鼠肿瘤生长和抗肿瘤免疫反应的影响。结果体外转染人肺癌A549细胞系,经间接免疫荧光和WESTEN-BLOT检测正确表达于胞浆,胞膜和细胞外。应用MTT法和WST-1补充实验发现,三种质粒对A549细胞系的生长抑制率存在差异,表现在:24h以内,跨膜型质粒对A549生长抑制率最高(32.31%),同胞浆型,分泌型和空载体相比有统计学差异(P<0.01)。48h以内,分泌型质粒对A549生长抑制率最高(52.75%),同胞浆型,和空载体相比有统计学差异(P<0.05)与跨模型无统计学差异。72h以后,三种定位表达质粒对A549生长抑制率无差异。流式细胞仪检测胞浆型、分泌型和跨模型质粒能够诱导A549细胞出现凋亡,24h内早期凋亡的比率分别为30.13%,39.29%和49.59%,72h总凋亡比率分别为48.27%,94.2%和54.56%。并且通过电镜和AO/PI双染激光共聚焦显微镜分别可检测到凋亡小体和死亡细胞。体外实验发现,从首次瘤内注射开始15天内,瘤内注射HN蛋白胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒和空质粒在控制肿瘤生长上无显著差异,在第18天和21天时跨模型质粒的抗肿瘤作用最强,同胞浆型、分泌型DNA质粒和空质粒相比具有统计学差异(P<0.05),收集小鼠脾淋巴细胞,经淋巴细胞增殖实验和CTL检测,发现HN蛋白的跨模型质粒组淋巴细胞增殖指数最高和效靶比为75:1时CTL活性最高,同胞浆型、分泌型DNA质粒和空质粒相比具有统计学差异(P<0.05)。结论定位表达于细胞膜上的HN蛋白即跨模型HN蛋白具有更高的细胞免疫优势,跨模型HN蛋白有望成为肺癌生物治疗的有效途径。更多还原