泛素-蛋白酶体系统参与的周期调节在全反式维甲酸(ATRA)诱导的白血病细胞分化过程中的作用研究

【作者】 方艳芬； 林美花； 周星露； 朱琼文； 杨波； 何俏军；

【机构】 浙江大学药学院药理毒理与生化药学研究所浙江；

【摘要】 目的:二十世纪八十年代,我国科学家率先将全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)成功应用于急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)治疗,它能特异性诱导APL细胞分化成熟,具有疗效显著、完全缓解率高、毒副作用小等特点,因此将APL由高度致死性发展为高度可治性疾病。但至今为止,ATRA诱导细胞分化的作用机制并未得到系统阐述。据文献报道,维甲酸诱导细胞分化过程伴随着明显的周期阻滞现象,与细胞分化、周期阻滞密切相关的蛋白均通过泛素-蛋白酶体通路降解。但是,关于泛素-蛋白酶体通路在维甲酸诱导白血病细胞分化中的作用并未见文献报道。本实验主要研究泛素-蛋白酶体通路在全反式维甲酸(ATRA)诱导白血病细胞分化过程中的作用,并初步研究其可能的作用机制。方法:用细胞计数法描绘细胞生长曲线,观察细胞增殖情况;采用流式细胞术检测细胞周期变化及细胞分化表面标记抗原CD11b表达;用荧光底物Suc-LLVY-AMC检测细胞内20S蛋白酶体活性;Real-time PCR检测细胞内泛素mRNA表达水平;Westernblotting法检测泛素化蛋白及周期相关蛋白变化。采用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞观察ATRA诱导的细胞分化作用。结果:ATRA诱导的细胞分化过程中,泛素蛋白酶体通路的活性明显增高,主要表现为:细胞内泛素化蛋白表达水平呈时间依赖性递增趋势,而泛素的mRNA表达水平也随着ATRA作用时间的延长而增加。用特异性荧光底物Suc-LLVY-AMC检测泛素-蛋白酶体通路中负责蛋白水解的20S蛋白酶体的活性,结果显示,ATRA可明显提高HL60、NB4细胞内20S蛋白酶体活性,呈明显的时间依赖关系,并于ATRA作用后72 h达到峰值。Western blot结果显示,两株细胞内G0/G1期相关的周期蛋白Cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6、Rb、E2F-1等蛋白均随着ATRA作用而呈时间依赖性递减趋势。应用MG132特异性抑制蛋白酶体活性,从而阻断泛素-蛋白酶体通路,观察ATRA对HL60、NB4的诱导分化作用。结果显示泛素-蛋白酶体通路被抑制后,ATRA诱导的细胞分化作用明显减弱,CD11b表达率较ATRA单用组明显减少,阻滞于G0/G1期的细胞明显少于ATRA单用组,提示泛素-蛋白酶体通路在全反式维甲酸诱导白血病细胞分化过程具有重要作用。Western blotting结果显示,MG132作用后,两株细胞内CDK4、CDK6、Rb、E2F-1较ATRA单用组没有明显变化;HL60细胞内Cyclin E蛋白明显累积,而CDK2蛋白没有明显变化;而NB4细胞内CDK2蛋白较ATRA单用组明显增加,Cyclin E蛋白没有明显变化。提示MG132的作用阻碍了周期蛋白的降解,从而使细胞不能有效阻滞于G0/G1期,进一步影响了细胞由不断增殖向分化状态转变的进程。但是我们发现在两株细胞内起关键作用的蛋白又不尽相同,深入的机制探讨有待进一步研究。结论:全反式维甲酸诱导细胞分化过程,泛素-蛋白酶体通路活性明显增强,该通路可能参与调节ATRA诱导的白血病细胞分化过程,其作用机制可能与泛素-蛋白酶体通路参与降解与细胞分化、周期阻滞相关的蛋白相关。本研究为全反式维甲酸诱导细胞分化的作用机制研究提供了一个全新的视角,有助于进一步深入系统研究维甲酸诱导的细胞分化作用机制。更多还原