HLA-B~*2715相关内质网应激及细胞因子变化在AS致病中的作用初步探讨

【作者】 祁军； 林智明； 廖泽涛； 胡栽颖； 张艳丽； 李秋霞； 魏秋静； 曹双燕； 古洁若；

【机构】 中山大学附属第三医院风湿科；

【摘要】 目的观察HLA-B*2715引起的内质网应激及其AS级联致病相关因子的变化,探讨HLA-B*2715与AS的相关致病机制。方法慢病毒载体的构建:1.包括对pUC57-B2715中HLA-B*2715序列的第559和560碱基进行定点突变,将目的片段插入pLVX-IRESZsGreen1慢病毒载体中。2.稳定细胞系建立:将构建好的三个慢病毒载体质粒以及空载体质粒和pLP1,pLP2和pLP/VSVG质粒分别转化DH5α,;用磷酸钙转染法共转染293T细胞,48h和72h两次收集含病毒上清。直接将每种含病毒上清分别感染U937细胞。用流式细胞分选仪筛选细胞,继续传代培养。应用流式细胞仪检测细胞表面HLA-B27表达情况。3.HLA-B*2715与AS致病相关的内质网应激和致病相关因子的变化研究:使用含有最佳浓度IFN-γ的培养基培养U937-Blank Virus,U937-B2704,U937-B2706和U937-B2715细胞,分别在4h,8h,12h,16h,20h,24h,48h和72h收集几种细胞的培养上清和提取总RNA。Real-Time PCR检测IL-1β,IL-6,IL-8,IL-12和TNF-α的mRNA表达。应用液相芯片技术检测所有细胞培养上清中五种细胞因子的浓度。结果1..HLA-B*2715阳性细胞GRP78表达显著高于HLA-B*2704和HLA-B*2706阳性的细胞。2.HLA-B*2715阳性的细胞发生内质网应激情况下,导致了IL-8和TNF-α明显升高,而IL-1β,IL-6,IL-12不分泌或极低分泌;这些变化与HLA-B*2704和HLA-B*2706阳性的细胞及HLA-B27阴性细胞类似但更显著。结论1.HLA-B*2715蛋白可能异常折叠从而导致了内质网应激;2.HLA-B*2715阳性细胞发生内质网应激后引发了AS相关的致病因子IL-8和TNF-α变化,其相关的致病机制值得进一步研究.更多还原