绒山羊Sertoli细胞的长期培养及分析

【作者】 苏慧敏； 罗奋华； 包佳婧； 萨初拉； 张学明； 张岩； 多曙光； 吴应积；

【机构】 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室；

【摘要】 Sertoli细胞从生精上皮基底膜延伸至管腔,是曲细精管中发现的极其重婴的体细胞。近年来体内和体外研究显示,Sertoli细胞充当抚育细胞,在精子发生阶段为发育中的生精细胞提供营养。Sertoli细胞为精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)连续自我史新,和减数分裂以及减数分裂后的生精细胞提供微环境和结构支持,并可形成血睾屏障为生殖细胞为提供免疫豁免。由于其重要性,人鼠、小鼠、人、狗、牛、猪等动物的Sertoli细胞的培养系统先后被建立,但是没有山羊Sertoli细胞培养的报道。为了研究绒山羊(Capra hircus).睾丸Sertoli细胞的功能及其对精子发生的影响,本研究采用2步酶消化法获得3-4月龄绒山羊睾丸单细胞悬液,利用差异贴壁法纯化绒山羊睾丸Sertoli细胞,建立绒山睾丸Sertoli细胞体外长期培养系统。相较于已报道的人Sertoli细胞只能在体外存活7代,且只有1.5代的细胞可冷冻保存,本研究分离的Sertoli细胞可在存活20代,且每代细胞都可以冷冻保存,在长期冷冻保存5年后,细胞形态没有发生变化。光学显微镜观察显示,新生的Sertoli细胞体积较小,直径约为20-50μm;成熟的Sertoli细胞体积较大,直径约为100μm。细胞形状呈卵圆形,存在突起,有多个核仁,活跃的Sertoli细胞在细胞核周围有较多的脂滴。正在分裂的Sertoli内具有多个细胞核,形成合胞体。透射电镜分析显示,体外培养的细胞彤念良好,具有典型的Sertoli细胞超微结构特征:细胞核呈现不规则状念,核膜有很深的缺刻;细胞质中具有许多的细胞器,如大量的粗面、光面内质网,线粒体,高尔基体,溶酶体,同时在核下胞质区有大量脂滴堆积,细胞核中具有明显的核仁和均匀分布的染色质颗粒;在合胞体中,最多检测到3个细胞核。免疫荧光染包检测显示几乎100%的培养细胞表达Sox9(SRY-related HMGbox gene 9),vimentin和GDNF(glial cell-derived neurotrophic factor)。随着传代次数的增加,细胞增殖速度减慢,但是GDNF,SCF(stem cell factor)和β1-integrin的转录水平并没有下降,表明该细胞有正常的调节精原干细胞增殖分化的助能。BrdU掺入实验利流式细胞仪分析显示,该细胞在冷冻保仔5年之后,仍然具有良好地增殖能力。结果显示,本研究培养的绒山羊Sertoli细胞在体外具有良好地增殖能力,表达重要的生殖细胞调节因子。这些细胞在Sertoli细胞与生殖细胞相互作用,精子发生,生殖毒理学和男性不孕研究方面具有重要的应用前景。更多还原