DJ-1^M261基因在NIH3T3细胞中凋亡的研究

【作者】 张梅英； 徐影琪； 王惟； 赵越； 于萌； 杨葳；

【机构】 中国医科大学实验动物部；

【摘要】 目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M²⁶¹重组表达载体,为研究DJ-1M²⁶¹基因与细胞凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M²⁶¹重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M²⁶¹质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的2种转染细胞在DNA水平、转录水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒检测转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M²⁶¹重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M²⁶¹基因的NIH3T3阳性细胞组增殖速率低于正常NIH3T3细胞组,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测实验结果表明转染DJ-1M²⁶¹基因的阳性克隆细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M²⁶¹重组表达质载体,DJ-1M²⁶¹基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。更多还原