单纯性马蹄内翻足患者SOX9基因表达及其调控机制的研究

【作者】 王正东； 金春莲；

【机构】 中国医科大学医学遗传学教研室； 沈阳医学院人体解剖学教研室；

【摘要】 为研究单纯性马蹄内翻足患者SOX9基因的表达研究及调控机制,从而对单纯性马蹄内翻足的基因诊断和治疗提供理论依据。用PCR-DGGE方法对84例单纯性马蹄内翻足患者静脉血SOX9上游1 100bp及外显子序列进行突变筛查。用RT-PCR,Real-time PCR方法检测15例患者组和9例同年龄对照组足踝部肌肉组织SOX9 mRNA表达水平,用Western免疫印记和免疫组织化学方法检测SOX9蛋白表达,比较两组表达差异。用激光扫描共聚焦显微镜观察SOX9及COL9A1表达部位。在SOX9基因上游1200bp区域构建系列截短的报告基因载体及结合位点的突变载体并行测序验证,将pGL-SOX9和pRL-TK载体共转染至RD细胞,进行双荧光素酶报告基因活性分析。用P-match软件在SOX9基因上游启动子区域预测结合蛋白,用EMSA和ChIP方法进行结合位点验证,并将HOXD13-SiRNA和pGL3-SOX9共转染至RD细胞,用双荧光素酶报告基因技术进行荧光素酶活性分析。RNA干扰RD细胞HOXD13表达,用Real-time PCR方法观察SOX9及COL9A1两个转录本的表达变化。结果显示患者组(12/15,80%)mRNA水平SOX9表达比对照组升高,蛋白水平上表达变化与mRNA水平表达变化具有一致性。激光扫描共聚焦显微镜显示SOX9与C019A1在ICTEV患者肌肉组织同时存在于肌膜、肌内膜及肌束膜内且位置重合,提示在二者在ICTEV足踝部软组织中可能存在某种关系。P-Match软件预测SOX9上游1200bp具有3个HOXD13结合位点,双荧光素酶报告基因技术活性分析显示SOX9上游-512至-368区域(即含有位点3)为负调控区并且位点3区域起主要负调控作用;用EMSA和ChIP验证HOXD13与该区域预测位点特异结合。将含位点3的pGL3-SOX9与HOXD13 SiRNA共转染RD细胞内其荧光素酶活性明显升高。干扰RD细胞HOXD13的表达,SOX9表达轻微升高,而COL9A1两个转录本表达均显著升高。以上结果提示单纯性马蹄内翻足患者肌肉组织(12/15,80%)SOX9基因mRNA和蛋白表达均升高,二者具有一致性。SOX9基因上游-512至-368区域(即含有位点3)为负调控区并且位点3区域起主要负调控作用,HOXD13蛋白可与此区域结合,该区域启动子活性与HOXD13表达成负相关。当HOXD13表达降低时SOX9表达轻微升高而COL9A1两个转录本表达均升高。提示HoxD13低表达导致SOX9高表达,高表达的SOX9导致COL9A1基因表达升高从而导致患儿软组织挛缩的发生。更多还原