造血干细胞宫内移植制备CML山羊嵌合体模型及基因表达谱的研究

【作者】 曾凡一； 陈美珏； 巩芷娟； 胡伟； 颜景斌； 蒋晓燕； 黄淑帧；

【机构】 上海交通大学医学遗传研究所；

【摘要】 目的慢性粒细胞性白血病（CML）是一种常见的恶性血液肿瘤,大多是由于9号染色体与22号染色体易位形成BCR-ABL融合基因过度表达酪氨酸激酶所致。药物治疗虽然能够缓解病情,但因为BCR-ABL残留细胞的存在,相当数量的病人会复发,因此建立该疾病动物模型来研究CML的发病机制、发病过程、早期诊断指标及药物筛选等都具有重要意义。方法首先分别用含有BCR-ABL融合基因载体MSCV-BCR-ABL-IRES-GFP（简称BCR-ABL）及对照载体MSCV-IRES-GFP（简称MIG）经逆转录病毒介导感染脐血来源的lin-CD34⁺细胞,然后通过宫内移植的方法在B超的监视下将上述整合外源基因的造血干细胞移植到孕45-55天的胎山羊腹腔内。每头胎羊移植2-10×10⁴个感染BCR-ABL或MIG的造血干细胞。受体胎羊出生后,运用分子遗传学、细胞生物学和流式细胞技术分析供体细胞在各组织的归巢和分布特征,FISH技术鉴定BCR-ABL细胞的存在,定期进行外周血白细胞数目的检测;采用基因表达芯片对BCR-ABL和MIG嵌合体山羊中人源基因的表达谱进行了系统的分析,并采用定量RT-PCR对部分基因的转录本进行验证。结果6头BCR-ABL移植羊和5头MIG移植羊足月分娩。1头BCR-ABL和2头MIG小羊在出生3月时剖解,PCR、定量PCR和FACS分析发现,在其外周血、骨髓、心、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌、平滑肌等组织器官中均检出了大量表达GFP基因的外源干细胞,而另外5头BCR-ABL和3头MIG嵌合体山羊的外周血和骨髓中也都检出了外源干细胞的存在。FISH分析证明只有BCR-ABL羊的外周血中含有染色体上整合了BCR-ABL融合基因的供体细胞。进一步分析显示,外源干细胞不仅可以在嵌合体山羊骨髓、肝、脾等造血器官中扩增（2-16%）,而且在某些非造血器官（如肌肉、心脏）中亦有一定程度的扩增。为了研究该嵌合体模型是否可以表现出CML的疾病特征,对BCRABL嵌合体山羊外周血中的白细胞数量及外源造血细胞的扩增情况进行了为期2年的连续观察。结果显示,与对照山羊相比,出生3周后BCR-ABL山羊外周血白细胞的数量提高了3-5倍(2.6×10¹⁰/L vs 5-12×10⁹/L),与MIG羊相比,其白细胞的数目也有显著的升高。BCR-ABL山羊高水平的白细胞数量一直维持到出生后1年,其后缓慢下降,但仍可在其外周血和骨髓中检测出BCR-ABL病毒转导的外源干细胞。BCR-ABL嵌合体山羊、MIG山羊和阴性对照山羊的基因表达芯片分析结果揭示,BCR-ABL嵌合体山羊外周血中至少有137条人源基因的表达上调,特别是酪氨酸激酶9（PTK9）、cAMP应答元件结合蛋白5（CREB5）和黑色素瘤抗原（MA）基因的表达水平比MIG山羊中至少升高2.5倍以上,具有显著的差异;而肝脏中酪氨酸激酶Cβ1（CK1）、转膜蛋白（MT75）和骨成形素蛋白7（BMP7）表达量也至少是MIG山羊的2.5倍以上。定量RT-PCR的结果也证实了上述表达差异的存在。结论研究结果证实已经成功地建立了能扩增外源BCR-ABL⁺造血干细胞的嵌合体山羊模型,从而为研究CML的细胞、分子机理及疾病的早期诊断和治疗提供了有价值的大动物（山羊）模型。更多还原