异种移植候选供体宁乡猪内源性逆转录病毒调查

【作者】 邢晓为； 易受南； 董琼； 叶斌； 童琼娟； 叶征； 王维；

【机构】 中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗研究所；

【摘要】 目的对异种移植候选供体宁乡猪携带的内源性逆转录病毒进行调查分析,为评价从猪到人异种移植中的生物安全性提供依据。方法从宁乡猪保种群中随机采集22头个体的血样标本,应用PCR技术分别对这些个体基因组中猪内源性逆转录病(porcine endogenous retrovirus,PERV)env-A,env-B,env-C基因及线粒体基因CoⅡ进行扩增,明确宁乡猪种群携带PERV的亚型;RT-PCR分别扩增PERVpol,gag基因,了解PERV是否具有转录活性;为进一步探索宁乡猪基因组中PERV-A, -B的序列变异及其特性,在PERV env序列上游设计一对PERV-A,-B共用引物,分别用高保真酶从3头不同个体中PCR扩增1.8 kb PERV env序列,然后,将PCR产物克隆至pUCm-T载体,PCR扩增法鉴定阳性克隆,并分别用限制性内切酶KpnⅠ和MboⅠ对所扩增的PCR产物进行酶切鉴定,测序分析不同酶切图谱的阳性克隆;最后,用两对不同的引物对PERV-C阳性的个体中的PERV-A/C重组序列进行PCR扩增,分析这些个体中是否存在PERV-A/C重组。结果所检测的21头宁乡猪均带有PERV前病毒DNA,PERV env-A,env-B,env-C存在于所有的个体中,说明宁乡猪具有3个PERV亚型,即:PERV-A,PERV-B, PERV-C三种。RT-PCR扩增结果表明,PERV pol,gag在所有个体中均有表达,说明宁乡猪中PERV均具有转录活性。应用共用引物PCR扩增1.8 kb PERV env序列后,克隆至pUCm-T载体,筛选得到42个阳性克隆,对所插入的片段PCR扩增并用KpnⅠ和MboⅠ进行双酶切,结果发现KpnⅠ酶切后的有6种酶切谱,MboⅠ酶切后的有8种酶切谱,结合两种酶切谱的结果共得到11种不同的克隆,其中PERV-A约为30%,该结果表明,宁乡猪中存在多种变异的PERV-A和PERV-B序列。PERV-A/C重组筛查结果发现,90%以上的宁乡猪带有PERV-A/C重组序列,提示该猪种携带PERV具有较强的跨种系感染能力。结论宁乡猪带有PERV前病毒DNA,PERV在该猪种中具有转录活性,该猪种携带3种PERV亚型,即:PERV-A,PERV-B,PERVC。在该猪种基因组中存在多种PERV-A和PERV-B变异序列,不易从基因组中剔除,而且绝大多数个体中均存在PERV-A/C重组,增加了PERV跨种系感染的风险,从生物安全性角度考虑,该猪种不宜作为异种移植候选供体为人类提供器官和细胞来源。更多还原