基于TCSPC技术的心肌细胞NAD(P)H荧光光谱和寿命的研究

【作者】 程颖； 任明明； Aneba S.； orvat Jr.D.； orvatova A.；

【机构】 北京大学深圳医院心血管外科； 蒙特利尔大学儿科学部,蒙特利尔大学医学中心圣-贾斯廷医院研究中心； 蒙特利尔大学儿科学部蒙特利尔大学医学中心圣-贾斯廷医院研究中心； 斯洛伐克国际激光中心生物光子学部； 蒙特利尔大学儿科学部；

【摘要】 目的:心脏的功能活动需要通过水解三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)提供能量支持,大量的ATP(>95%)在心肌细胞线粒体中合成,NADH作为主要的电子提供者在线粒体呼吸链第Ⅰ复合体酶被氧化脱氢为NAD+,合成88%的ATP。紫外激光(λ=375nm)可激发心肌产生来源于线粒体还原型NADH和NADPH(或NAD(P)H)的自发荧光(autofluorescence,AF),NAD(P)H被氧化为NAD(P)+后,即失去原有的荧光特性。因此应用光谱分辨的时间相关单光子计数技术(spectrally-resolved time correlated single photon counting,TCSPC)学习心肌AF光谱和荧光寿命的指纹特征,通过分析NAD(P)H/NAD(P)+氧化还原比例,可以评估线粒体的氧化代谢状态。发现线粒体功能改变的早期信号。方法:我们将NAD(P)H作为无创荧光探针,用TCSPC同时记录UV激发心肌细胞NAD(P)H荧光光谱和荧光寿命,测试影响NADH生产或干扰线粒体呼吸的试剂对心肌AF衰减动力学的作用,以及模拟心肌缺血状态下心肌AF的改变。结果:在420-560nm光谱区域,需要至少3个荧光寿命池,分别为0.4-0.7ns(相关振幅:69.3±8.4%)、1.2-1.9 ns(27.6±8.4%)和8.0-13.0ns(3.1±1.6%)来描述心肌细胞AF。酮体增加线粒体NADH产量,明显提高AF强度,但不改变光谱形态和荧光寿命。线粒体呼吸链第Ⅰ复合体酶阻断剂Rotenone,显著增加AF强度和缩短平均荧光寿命。氧化磷酸化解偶联剂Dinitrophenol(DNP),显著降低AF强度,在520nm处增宽荧光光谱并显著延长平均荧光寿命。在模拟缺血环境中,心肌AF强度显著增强, DNP对心肌荧光的作用减弱,同时我们计算出在450nm处,线粒体呼吸链氧化可用的NADH比例由正常对照的82%下降至43%。这些结果和NADH荧光动力学离体实验(in vitro)有可比性。结论:光谱分辨的荧光寿命技术是研究心肌NAD(P)H荧光的新工具。荧光寿命(fluorescence lifetime)不仅能反映各荧光团构象或分子复合体的荧光分布,而且对荧光团的内部反应和周围环境很敏感。荧光光谱分析结合荧光寿命测定是监测心肌线粒体氧化代谢的敏感方法,可快速和重复地测定光谱分辨的复合自发荧光衰减,解释荧光团构象改变,以及荧光团间能量转移。研究增加了心肌氧化代谢或线粒体功能障碍及心肌重塑在细胞水平上的知识,开拓了诊断和治疗心肌疾病的新视野。更多还原