SeNHX1基因转化拟南芥的初步研究

【作者】 张洁； 薛晓峰； 魏琦超； 游建； 袁重要； 程婷婷； 王楠； 周岩；

【机构】 河南科技学院生命科技学院；

【摘要】 本实验利用Floral dip法将EHAl05根癌农杆菌Ti质粒携带的耐盐基因SeNHX1（及筛选基因Kan^r和报告基因GUS）导入拟南芥Columbia-0中,以期获得转化植株,并探讨不同浓度农杆菌及不同浸染时间、转化缓冲液中不同成分（MS、5%蔗糖及500μL/L的表面活性剂Silwet L-77）对转化拟南芥的影响。拟南芥植株在移栽后培养约1.5月,当茎高生长至5cm时,去其顶生花序。继续生长7～9 d,当侧枝长度为2-10cm,植株出现较多未开放的花蕾和极少数的果荚时,即可用于转化。农杆菌在含Kan的LB液体培养基中,28℃,培养1.5 d。收集菌体并分别悬浮于下列转化缓冲液:①MS、5%蔗糖、500μL/L的表面活性剂SilwetL-77;②5%蔗糖、500μL/L的表面活性剂SilwetL-77;③MS、5%蔗糖;④MS、500μL/L的表面活性剂Silwet L-77;上述四种转化缓冲液酸碱度均为pH 5.8。将拟南芥植株倒置于转化缓冲液中,每种含有农杆菌的转化缓冲液设置3个浓度,OD₆₀₀值分别为0.752、1.256和1.752,且每种浓度设置3个浸染时间:1.5 min、2.0 min和2.5 min。经浸染后的植株侧置于托盘上,22℃下覆膜培养3～4 d,去膜后培养6 d即可进行第二次浸染,随之覆膜培养1 d,去膜后培养至果荚变黄,收集种子。将T0代种子播种至含有1‰Kan的MS培养基上,萌发后统计出苗率。结果显示,含有农杆菌的转化缓冲液①出苗率最高,②比①略低;③和④明显低于①,其出苗率仅为①的31%和16.7%;浸染浓度为1.752、浸染时间为2.0 min的出苗率最高,达1.86%。对抗性出苗植株进行GUS检测,结果显示,58.3%的植株呈阳性。利用PCR技术对抗性出苗植株进行进一步检测,发现GUS染色中呈阳性的植株和68.7%呈阴性的植株均为阳性。综上所述,转化缓冲液①是最佳配比,其中,MS对出苗率影响不显著,转化缓冲液中缺失蔗糖或表面活性剂Silwet L-77时会极大降低出苗率,且蔗糖对植株转化影响最显著。菌液的浸染浓度和浸染时间对出苗率具有较大影响,菌液浓度为1.752、浸染时间为2.0 min是最优浸染组合。本研究耗时80 d左右,目前统计得到1.05%的转化率。对转化植株的进一步分子生物学鉴定还有待于进行。更多还原