鸡源志贺菌IpaC基因的克隆及原核表达

【作者】 苗银萍； 蒋大伟； 许兰菊； 王川庆； 尤晓楠； 李克宇；

【机构】 河南农业大学 牧医工程学院；

【摘要】 本研究对鸡源志贺菌IpaC基因进行了克隆、重组表达与鉴定及蛋白纯化。首先,应用PCR方法从志贺菌毒力大质粒中扩增出大小为1092 bp的目的基因,与国内外发表的10株人源志贺菌IpaC序列进行同源性分析、结果表明鸡源志贺菌IpaC基因与参考菌株的核苷酸序列同源性为97.3%-99.8%、氨基酸序列同源性为96.4%-99.7%。进化树结果显示,与参考株AL391753相似性较大,它们在同一个分支上。然后,将该基因克隆至载体pET32a(+)中,构建了原核表达载体pET32a(+)-IpaC,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达并进行表达条件的优化。SDS-PAGE电泳结果显示:在相对分子量约63 kDa处出现条带,而对照组无目的条带产生。最佳表达条件确定为诱导前培养3 h、IPTG终浓度为1.0 mmol/L、加入IPTG诱导4 h。最后,大量表达目的蛋白并裂解细菌进行可溶性鉴定,结果蛋白既存在上清中也存在包涵体中。上清蛋白经Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化后纯度可达90%以上。Western Blot分析显示,重组蛋白与ZMD-01株阳性血清发生特异性反应,证明表达产物具有良好的反应原性。更多还原