体细胞克隆制备肌肉生长抑制素(Myostatin)基因敲除猪

【作者】 李鸿辉； 冯冲； 王宁； 闫军； 龙川； 郑道山； 李西睿； 罗学明； 朱彦宾； 潘登科；

【机构】 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所；

【摘要】 【目的】肌肉生长抑制素（Myostat in,MSTN）是一类对骨骼肌生长具有负调控作用的因子,MSTN基因的缺失或突变会引起其骨骼肌重量的显著增加。因此,生产MSTN基因敲除猪有望提升猪胴体瘦肉率,达到提高饲料利用率的目的。【方法与结果】本研究首先利用"gap-repair"基因抓捕技术,从含大白猪MSTN基因座的BAC（细菌人工染色体）上亚克隆9.9 kb的打靶同源长臂（LA）,采用PCR的方法扩增1.5kb的打靶同源短臂（SA）,然后将获得的SA和LA连接到打靶骨架载体pLOXP上,构建含有neomycin和HSV-tk正负筛选标记的猪MSTN基因打靶载体pLOXP-MSTN-KO。将打靶载体线性化后,通过电击转染大白猪胎儿成纤维细胞系09LW3和09LW6,利用含有600μg/mL的G418和2μM的GANC的正负筛选培养液进行约7～10天的筛选,经过PCR鉴定和测序验证获得了MSTN^+/-单等位基因敲除的细胞克隆点4个。以其中2个MSTN^+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将早期重构胚移植到8头受体猪中,5头受体妊娠。将其中1头妊娠37天的代孕母猪处死,共获得5个胎儿,经过PCR鉴定有1头为MSTN基因敲除胎儿,其余为随机整合转基因胎儿。【结论】本研究初步建立了体细胞基因打靶技术制备MSTN^+/-基因单敲除克隆猪的体系,获得了基因敲除的胎儿,为MSTN^+/-猪的制备奠定了基础。更多还原