水牛转基因克隆胚胎的制备

【作者】 陆凤花； 罗婵； 李楠； 王建； 韦英明； 石德顺；

【机构】 广西大学动物繁殖研究所；

【摘要】 主要是探讨利用体细胞核移植技术制备水牛转外源基因(EGFP)克隆胚胎的可行性。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,放入含有5μg/ml细胞松弛素的操作液中,在装有Spindle View系统的显微操作仪下进行去核。采用电转的方法,将EGFP基因转染到水牛胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞作为核供体,经核移植和电融合后构建核移植重构胚。重构胚经5μM离子霉素激活处理5min并在2mM的6-DMAP中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中(30μl)培养7-9天,观察其卵裂和胚胎发育情况,并在荧光显微镜下,观察重构胚EGFP的表达情况。结果显示:以转基因细胞为核供体构建的重构胚,在荧光显微镜下观察,发现重构胚在2-4细胞阶段观察不到绿色荧光蛋白的表达,在8-16细胞后可观察到绿色荧光蛋白的表达,而且绿色荧光蛋白在每个卵裂球中均匀表达,但其荧光强度很弱;随着胚胎的发育,其荧光强度有所增强,并在囊胚阶段的内细胞团、滋养层细胞中都有绿色荧光蛋白的表达,且囊胚内细胞团的荧光表达强度最强。同时比较了转基因细胞和非转基因细胞核移植后重构胚的发育情况,发现转基因细胞核移植后重构胚胎的分裂率为72.2%(262/363),分裂胚胎阳性率为39.9%(145/363),囊胚率为18.5%(67/363),囊胚阳性率为18.2%(66/363),胚胎的分裂率与非转基因细胞构建的重构胚的分裂率(75.6%,198/262)之间差异不显著(P>0.05),而囊胚发育率差异显著(18.5%VS 27.9%,P<0.05)。以上结果表明,EGFP可以作为一种标记基因,用于转基因克隆水牛的制备;且用电穿孔法转染水牛胎儿成纤维细胞可以有效的生产水牛转基因克隆囊胚。更多还原