旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达及抗原性分析

【作者】 盖文燕； 李文卉； 王鸿盛； 姚菊霞； 曲自刚； 王艳华； 张德林； 付宝权；

【机构】 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室；

【摘要】 根据GenBank中旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerPIN)基因序列设计引物,从中国河南猪旋毛虫分离株肌幼虫总RNA应用RT-PCR扩增获得目的基因片段,克隆到pMD-18T载体并测序鉴定。对重组质粒pMD-18T-TsSerPIN进行限制性酶切,获取目的基因片段后连接到表达质粒载体pET30a,构建重组表达质粒pET30a-TsSerPIN,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,对表达产物纯化后用Western-blot方法和ELISA鉴定TsSerPIN重组蛋白的抗原性。构建的重组表达质粒pET30a-TsSerPIN阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致,测序鉴定无基因突变,开放阅读框正确。含有pET30a-TsSerPIN重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为42.5kDa,而且主要以包涵体形式存在。Western-blot和ELISA结果表明TsSerPIN重组抗原可以被旋毛虫感染猪阳性血清特异性识别,具有良好的抗原性,可以作为猪旋毛虫病免疫诊断的候选抗原。更多还原