乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

【作者】 闫丽萍； 华荣虹； 亓文宝； 童光志；

【机构】 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室； 华南农业大学兽医学院；

【摘要】 流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B;Japanese Encephalitis,JE)简称乙脑,是由乙型脑炎病毒(Epidemic Encephalitis B Virus;Japanese Encephalitis Virus,JEV)引起的中枢神经系统疾病,由蚊虫传播,主要流行于东亚和东南亚各国,近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势。感染后死亡率高,愈后患者会留下不同程度的后遗症。JEV的囊膜蛋白(即E蛋白)是乙脑病毒的主要结构蛋白,它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。1999年Kolaskar等[1]通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测,认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成,其中结构域Ⅱ独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样结构,由于这种构象,许多抗原中和表位都集中于此结构域。目前对于E蛋白的结构域Ⅱ(EⅡ)的抗原表位还不清楚,为了对结构域Ⅱ进行抗原表位研究,首先原核克隆表达了EⅡ,结果表明,原核表达产物可被抗JEV阳性血清识别。并且利用一组覆盖该区域的短肽融合蛋白通过蛋白免疫印迹和ELISA反应,进行表位鉴定,同时也对结构域Ⅱ的免疫特性进行了研究。为了对EⅡ(292~402氨基酸残基)这一长111氨基酸残基的片段进行抗原表位作图,设计了一套覆盖整个EⅡ的短肽组,命名为E37~E50,这些短肽长为16个氨基酸,相互重叠8个氨基酸。为了表达这些短肽,设计合成了14对寡核苷酸链。在编码链的5’端引入BamH I位点,在3’端引入XhoI位点,反义链与编码链互补,且退火后形成的双链DNA正向为BamH I粘性末端,反向为XhoI粘性末端,可直接与酶切线性化处理的载体pGEX-6P-1相连接。重组子经酶切鉴定后命名为pGEX-E37至pGEX-E50,各重组质粒送北京英骏生物技术有限公司测序以验证序列。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21,进行诱导表达及SDS-PAGE电泳分析各短肽蛋白表达情况。从分析结果看各融合蛋白均获得了表达,可溶性短肽融合蛋白用谷胱甘肽Sepharose4B RediPack亲和层析柱(Pharmacia Biotech)纯化,不溶性短肽融合蛋白经超声波洗涤纯化.纯化样品与1:100稀释的JEV阳性血清进行蛋白质免疫印迹和ELISA分析,结果表明,表达融合蛋白GST-E39(305~320),GST-E45(353~368),GST-E47(369~384),GST-E48(377~392),和E49(385~402)能被JEV阳性血清所识别。由于GST-E47、GST-E48、GST-E49是一个连续的氨基酸序列,为了确定抗原表位的主要功能性区域,将该段氨基酸进一步划分,通过蛋白质印迹结果表明该区域含有两个抗原表位,即GST-E48-1(377~384)、GST-E49(385~402)。同时,由于鉴定出的表位E45(353~368)的融合蛋白以包涵体的形式存在对E45进行相应的细分,蛋白质印迹结果发现E45-1(355~366)能被JEV阳性血清所识别。14个相互重叠且覆盖EⅡ全长区域的短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹及ELISA扫描,以及通过免疫印迹进一步精确定位后,最终确定GST-E39、GST-E45-1、GST-E48-1、GST-E494个抗原表位,表位作图如下其结果对进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有重要意义。更多还原