蛋白激发子PeaT1互作蛋白的鉴定及功能分析

【作者】 孟繁露； 邱德文； 杨秀芬；

【机构】 中国农业科学院植物保护研究所；

【摘要】 近年来,植物识别病原微生物的机制已经成为植物免疫领域的研究热点,越来越多的人把目光锁定在寻找植物激发子的受体上,以期从激发子与植物受体互作的角度更深层次的了解植物免疫防御系统。迄今为止,虽然已经有不少关于激发子受体的报道,但整体而言缺乏系统性,研究进展相对缓慢。本文用多种研究蛋白互作的方法从烟草质膜中分离得到真菌蛋白激发子PeaT1的互作蛋白PeaT1-BP,通过对其生理生化特性研究发现二者能在植物体内和体外稳定结合,推测PeaT1-BP是蛋白激发子PeaTl在烟草上的潜在识别受体。用荧光素FITC标记PeaT1并分别与烟草悬浮细胞和原生质体孵育,激光共聚焦显微镜观察到FTTC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合,说明在烟草细胞质膜上有蛋白激发子PeaT1的结合位点。利用Far-Western方法从烟草膜蛋白双向电泳凝胶中钓取到一个跨膜多肽,属于膜蛋白家族DREPP。根据CDS序列设计特异性引物,克隆得到该蛋白编码区全长594bp,由197个氨基酸组成,理论分子量为22kDa,将该蛋白命名为PeaT1-BP。Blast序列比对分析表明,PeaT1-BP与Ca²⁺结合蛋白PCaPs的N端序列有高度同源性,该蛋白N端序列与磷酸化、Ca²⁺变化等信号传导的早期事件密切相关,是拟南芥细胞膜上介导信号传递的重要因子。为了进一步确定PeaT1-BP互作蛋白的亚细胞定位,将Pea Tl-BP蛋白序列插入到含有绿色荧光蛋白GFP标签的瞬时表达载体pGDG中,重组载体转化脓杆菌LBA4404并注射烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察发现,烟草质膜边缘发出绿色荧光,说明表达蛋白定位于质膜,进一步印证了分离的PeaT1-BP是一种烟草膜蛋白。将PeaT1-BP的CDS序列插入表达载体pET-30 Ek/LIC载体中,转化E.coli Transetta细胞,诱导表达获得可溶表达蛋白。利用亲和层析和阴离子交换技术纯化重组膜蛋白,蛋白纯度达90%以上。用多种基于不同原理的蛋白互作技术对PeaT1与PeaT1-BP进行了体内和体外结合验证。Far-Western和免疫共沉淀两种检测方法均表明PeaT1-BP和PeaT1能在细胞外稳定特异结合。用双分子荧光标记（BiFC）技术进一步验证膜蛋白与PeaTl在烟草细胞内结合。以上研究结果为揭示植物对真菌蛋白激发子的识别机制提供了理论依据。更多还原