油菜抗菌肽基因的快速筛选及活性检测

【作者】 黄金； 黄军艳； 柯涛； 马向东； 董彩华； 刘胜毅；

【机构】 中国农业科学院油料作物研究所/农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室； 湖北大学生命科学学院； 南阳师范学院生命科学与技术学院；

【摘要】 抗菌肽是广泛存在于生物体内能够抵御外界微生物侵害的小分子肽,是宿主免疫防御系统的重要组成部分。由于抗菌肽具有高效、环保、耐药性强等优点,近年来已成为植物抗病基因工程的研究热点。一些抗菌肽在植物中表达后显示了良好的抗病效果,如水稻中表达天蚕素显著提高了水稻对白叶枯病的抗性;将马蹄蟹白细胞抗菌肽基因转入马铃薯后提高了其对软腐病的抗性等。本研究利用油菜ESTs数据库中的序列信息及油菜、白菜和甘蓝全基因组测序结果,通过生物信息学的手段在全基因组范围内进行油菜抗菌肽基因的预测和分析,我们已经初步获得了油菜中近1 000条与已知抗菌肽有类似序列结构特征的候选基因。从中筛选了40个属于不同基因家族的抗菌肽基因用于人工合成及活性检测。这40个基因平均长度为135bp左右,编码45个氨基酸,通过overlap PCR方法已完成了40个抗菌肽基因的人工合成。本研究利用猪瘟病毒定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,构建了一个能高效准确表达抗菌肽基因的载体pET30a-EDDIEGFP。将人工合成的抗菌肽基因克隆该表达载体上,在大肠杆菌中表达得到的包涵体融合蛋白在体外复性,并通过融合蛋白EDDIE的自我剪切,从而获得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽产物。以大肠杆菌、藤黄八叠球菌为革兰氏阴性菌和阳性菌的标准菌株,检测抗菌肽对细菌的抑菌活性;以一系列的植物病原真菌如核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰霉菌(Botrytis cinerea)等为靶标,对抗菌肽进行真菌生长抑制活性鉴定。目前初步得到21个对G+,G-及真菌有明显的抑菌作用的油菜抗菌肽基因,后续研究正在进行中。本研究在全基因组水平上系统高通量挖掘抗菌肽基因,通过批量筛选获得具有高抑菌活性的抗菌肽基因,为植物抗病性遗传改良提供基因源和理论指导。更多还原